《Signal Transduction and Targeted Therapy》：The making of cells and organs in xenogeneic animal bioreactor
器官移植是终末期慢性疾病或绝症患者最有效的治疗选择。根据世界卫生组织2020年发布的数据，全球每年有超过两百万患者等待器官移植以挽救生命。然而，器官供应与需求之间的平均比率仅为1:20至1:30。供体器官的数量不足以满足临床和患者的需求。在美国，卫生资源与服务管理局报告称，平均每天有17人在等待捐献器官时死亡。针对这一问题，研究人员正在探索多种方法，包括利用3D生物打印、脱细胞和再细胞化技术以及干细胞和类器官在体外合成人体组织或器官。在体外器官发生领域，目前有三种方法正在使用。然而，3D生物打印受到高成本和干细胞定向分化等问题的困扰。脱细胞方法则需要解决干细胞在脱细胞生物骨架上精确空间定位以及分化细胞归巢能力的问题。同时，类器官存在尺寸缺陷、可重复性差和缺乏血管化等问题。还值得注意的是，所有这些方法通常都处于基础研究阶段而非临床应用，因此需要进一步的技术突破。此外，在猪器官直接异种移植以及基于异种动物作为体内生物反应器生成功能性可移植细胞、组织和器官方面已开展了初步应用。猪器官因其与人体组织在解剖学和生理学上的相似性以及尺寸兼容性，被确定为异种移植（即涉及将器官或组织从一个物种移植到另一个物种的移植医学领域）的最佳候选对象。迄今为止，研究工作的重点一直放在开发基因修饰的猪器官（如肾脏、心脏和肝脏）用于人类异种移植试验。第一位接受猪心脏移植的患者术后存活了59天，从而证明了异种移植的可行性。尽管如此，仍有一些问题有待解决，例如免疫排斥、补体和凝血系统的不兼容性以及人畜共患病的风险。利用异种动物作为生物反应器作为一种体内方法展现出相当大的前景。在活体动物内生成细胞、组织或器官的过程被称为体内生物反应器，已被证明有助于复杂的发育程序、氧气和营养物质的供应以促进器官发育。该领域已确定了通过利用异种动物作为体内生物反应器来生产所需细胞、组织或器官的三种主要方法（图1）。在这三种方法中，囊胚补偿（blastocyst complementation）受到的关注最多。尽管种间嵌合体存在挑战，但生成具有复杂三维结构的人体器官的最有效方法是通过囊胚补偿过程，利用人类多能干细胞（PSCs）填充异种动物（尤其是猪）囊胚中未被占据的器官生态位。猪较短的妊娠期和增多的窝产仔数使这种方法成为一种更省时且更高产的策略。因此，利用囊胚补偿作为一种在猪体内生成人体组织或器官的方法，是解决可移植器官短缺问题的一种更先进的方法，具有巨大潜力。除了通过囊胚补偿生成系统性嵌合体外，还可以通过“器官发生生态位方法”（organogenic niche method）形成局部嵌合体，即在通过条件性基因敲除获得的异种动物空器官生态位中，在器官发生过程中分化器官祖细胞。在异种嵌合体中，供体细胞与宿主的发育阶段匹配至关重要。“器官发生生态位方法”与囊胚补偿不同，它是将祖细胞注射到中晚期胚胎中。“发育沙漏模型”认为，在胚胎的器官发生时期，物种之间的发育差异较少。此外，利用分化潜能有限的祖细胞形成的局部嵌合体，可以避免对非靶器官（尤其是大脑和生殖细胞）的贡献。目前，这种方法主要应用于肾脏。最后一种方法，利用出生后异种动物作为生物反应器来扩增细胞，已应用于肝细胞和血细胞（图2）。本综述总结了基于异种动物作为体内生物反应器生成功能性可移植细胞、组织和器官的当前研究。同时，对体外生成技术的进展和局限性以及转基因异种动物器官的利用进行了简要概述和探讨。文本接着讨论了供体PSC状态、基因修饰的受体动物以及一些种间嵌合屏障对种间嵌合体形成的影响。本综述旨在全面概述异种动物中细胞、组织和器官的生成。研究人员假设，在不久的将来，可以在猪体内生成功能性且可输注的人类临床血液制品（包括白细胞、红细胞和血小板），用于临床转化。
囊胚补偿
囊胚补偿是一种将供体多能干细胞（PSCs）注射到缺乏器官发生所必需关键基因的受体囊胚中的技术。这允许供体PSC来源的细胞占据缺陷器官生态位并补偿缺陷，从而在受体动物中形成供体功能性组织或器官。从历史上看，小鼠胚胎干细胞（ESC）-四倍体胚胎嵌合体的产生可以被视为第一次补偿试验。在这种方法中，四倍体胚胎固有的无法产生胚胎自身的能力由小鼠ESCs补偿。因此，胚胎和动物完全来源于小鼠ESCs。这种方法提供了确凿的证据，证明ESCs可以产生发育中胚胎的所有器官，包括长期重建造血干细胞。后来，囊胚补偿主要用于研究小鼠发育中的基因功能。1993年，Alt及其同事首次尝试了种内囊胚补偿。该研究将来自野生型小鼠的胚胎干细胞（ESCs）注射到具有Rag2基因缺陷的小鼠囊胚中。结果，研究人员在这些无法产生成熟淋巴细胞受体小鼠中鉴定出供体干细胞来源的成熟B细胞和T细胞。这一发现随后拯救了嵌合体中的适应性免疫反应。直到2007年，囊胚补偿才开始用于器官发生。然而，这种方法仅限于小鼠的种内嵌合。随后，Nakauchi及其同事首次证明，通过使用大鼠多能干细胞（rPSCs）在小鼠中生成大鼠胰腺，囊胚补偿可用于跨物种器官发生。一项后续研究表明，通过囊胚补偿在小鼠中生成的这些大鼠胰腺组织被移植到大鼠的胰腺缺陷模型中，并发现它们逆转了其表型。在啮齿动物胰腺嵌合成功之后，囊胚补偿主要被用于在异基因或异种动物中获取供体来源的组织和器官。囊胚补偿不仅用于啮齿动物，还用于大型动物物种，包括猪、牛和非人灵长类动物。
自2010年首次在小鼠中生成大鼠功能性胰腺以来，研究人员尝试通过种间囊胚补偿在小鼠和大鼠中生成多种组织和器官，包括胸腺、心脏、肾脏、肺、甲状旁腺、内皮细胞和生殖细胞。尽管该领域研究取得了进展，但胚胎发育领域仍存在一个持续的挑战。具体而言，在除胰腺和胸腺以外的器官研究中，普遍存在出生后不久停滞或死亡的问题。虽然小鼠目前是应用囊胚补偿生成种间嵌合体最常用的动物，但人类和小鼠在器官大小和胚胎发育速率方面的显著差异可能损害人-鼠嵌合体研究的效率和实用性。因此，必须扩大宿主物种的范围，以通过种间囊胚补偿有效生成人类可移植的组织和器官。种间囊胚补偿在各动物物种中的当代研究进展见表1。囊胚补偿领域已取得进展，在猪和牛等大型动物中的应用取得了显著进展。在这些动物中，猪一直是研究重点，因为它们是与人多能干细胞（hPSCs）嵌合的最理想的人类器官培育动物。
啮齿动物中异种组织和器官的生成
啮齿动物，尤其是小鼠，是种内和种间嵌合体研究中最常用的动物模型。这主要是因为建立基因敲除小鼠的方法比大型哺乳动物模型更简单。此外，利用小鼠进行此项研究具有经济和时间上的优势，突出了在该物种中建立器官生态位方法的效率和成本效益。虽然由于啮齿动物与人类在胚胎大小和发育过程上存在显著差异，啮齿动物不适合作为生成人类器官的生物反应器，但在啮齿动物上进行的研究可以为种间嵌合体的发展提供坚实的理论基础和技术储备。此外，啮齿动物可以作为基础研究和药物筛选中的人类疾病模型。迄今为止，已在小鼠中成功生成了完整的大鼠胰腺和胸腺，以及在大鼠中生成了完整的小鼠胰腺。这两者均已验证可用于移植。此外，在啮齿动物中生成其他器官、组织和功能细胞也取得了一些进展。相反，迄今为止尚未在啮齿动物中利用hPSCs生成人类器官。
胰腺
2010年，Nakauchi及其同事利用小鼠和大鼠诱导多能干细胞（iPSCs）进行了种间嵌合实验。研究人员将大鼠iPSCs注射到具有胰腺发育不全缺陷的Pdx1基因敲除（KO）小鼠囊胚中。注射成功，并在小鼠中获得了来源于大鼠iPSCs的胰腺。这是首次在异种动物中获得完整的功能性器官。重要的是，这些嵌合体正常生长至成年，并维持正常的血清乳糜微粒水平。然而，来源于受体小鼠的胰腺其大小与小鼠器官相当，因此不足以分离出治疗大鼠糖尿病所需数量的胰岛。随后，进行了反向实验，将小鼠多能干细胞（mPSCs）注射到Pdx1缺失的大鼠囊胚中，形成了来源于mPSCs且大小与大鼠胰腺相当的胰腺。因此，可以分离出足够数量的胰岛，并将其移植到链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中。令人惊喜的是，这些在大鼠中生成的小鼠胰岛在无免疫抑制的情况下，维持了糖尿病小鼠的正常血糖水平超过370天。这些发现证明了通过囊胚补偿在异种动物中生成功能性器官的可行性，并指出了其治疗潜力。
胸腺
Isotani等人用大鼠胚胎干细胞（rESCs）补充了缺乏胸腺的Foxn1基因缺失裸鼠的囊胚，随后获得了主要由大鼠细胞组成的胸腺。rESC来源的胸腺表现出功能性，因为在种间嵌合体中检测到了CD4
+和CD8
+单阳性T细胞。将生成的胸腺移植到缺乏胸腺的裸鼠肾囊下八周后，在裸鼠中检测到CD4
+和CD8
+细胞，进一步证明了在小鼠中生成的大鼠来源胸腺的功能性。然而，小鼠T细胞在rESC来源的胸腺中成熟的机制尚未阐明，生成胸腺尺寸小于大鼠胸腺的原因也尚不清楚。必须确定这种大小差异是否归因于种间发育不相容或大鼠细胞贡献减少。需要进一步研究来解决这些问题。
心脏
与其他器官相比，利用基因敲除动物模型通过囊胚补偿生成心脏被证明是一项艰巨的任务，因为其与复杂的心脏发生过程密切相关，该过程涉及众多关键基因的复杂相互作用，包括Mesp1、Tbx5、Nkx2.5和Gata4。因此，通过敲除单个或两个基因来创建完整的心脏生态位仍然是一项艰巨的任务。虽然已证明将rPSCs注射到Nkx2.5-KO小鼠的囊胚中可以挽救胚胎发育，但生成的心脏的心肌细胞由rPSC来源的细胞和小鼠细胞共同组成，并且发现嵌合胚胎未能存活至足月。为了获得完全由大鼠细胞来源的心肌细胞组成的心脏，Coppiello等人使用了选择性细胞消融方法，该方法允许在Nkx2.5-Cre;R26-白喉毒素亚基A（DTA）小鼠模型中消融所有表达Nkx2.5的心肌细胞。这创建了一个完整的心脏生态位。这种方法强调利用细胞消融在具有多个关键基因或尚未鉴定出关键谱系分化基因的组织中创建空的发育生态位。将rPSCs注射到囊胚后，在小鼠胚胎中观察到几乎完全由大鼠来源的心肌细胞组成的有节律搏动的心脏。然而，嵌合体小鼠胚胎可能在E10.5后死亡，这可能是由于嵌合体中的血管区室未能正确形成以支持正常的胚胎氧合，此外一些血管内皮细胞也表达Nkx2.5，正如先前在其他研究中观察到的那样。这些研究强调了在囊胚补偿中选择合适基因和方法来构建完整器官生态位的重要性，心脏就是一个例子。
与在体内生成的整个心脏相比，体外由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的心肌细胞可用于心脏再生治疗，从而为心脏供体短缺提供替代治疗。然而，hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在结构和功能上不成熟，表现出与胎儿心肌细胞相似的特征。与成人心室心肌细胞相比，hiPSC-CMs已被证明具有自主节律性，导致移植后在宿主中可能产生植入性心律失常，这阻碍了其临床应用。三维培养，包括工程化心脏组织和由hiPSC-CM球体聚集形成的心脏球体（CS），已被证明可促进hiPSC-CMs的成熟。将工程化心脏组织移植到心肌梗死小鼠的梗死区已被证明能显著改善心脏功能并促进血管生成。患有由缺血性心脏病引发的严重心力衰竭的患者，在心脏移植后观察到部分恢复。然而，由于使用异体细胞，患者需要长期服用免疫抑制剂以避免免疫排斥的风险。然而，这种细胞疗法目前面临几个挑战。如果移植的细胞含有来自hiPSC分化的非心脏细胞污染或未分化的hiPSCs，则存在在移植部位或异位诱发肿瘤的可能性。此外，生物材料的安全性和三维培养的标准化也引发了担忧。
虽然细胞疗法已被证明能暂时缓解心力衰竭，但器官移植仍是主要治疗方式。然而，鉴于心脏结构和血管化的复杂性，心脏类器官（COs）开发的重大进展一直缓慢。目前，在体外生成结构完整的心脏类器官仍然不可行。在结构组织方面，已开发出具有心房和心室样结构、管腔、心外膜成分和心肌层的hPSC-COs。在解决血管化问题方面，Wu JC及其同事最近成功构建了心血管类器官，其表现出空间组织、分支和管腔血管网络。这些类器官在结构和功能上与受孕后6.5周的人类胚胎心脏相似，尽管它们包含的造血细胞类型较少。心脏类器官也面临许多需要解决的挑战。这些包括CO诱导效率低、可重复性低和组织不成熟。此外，管腔不同于真实体内心脏中观察到的四腔管腔结构。缺乏通过血管系统的真正灌注导致无法搏动。
为了解决当前心脏供体短缺的问题，基因修饰的猪心脏也可以作为替代供体。已有两项试验将基因编辑的猪心脏移植到活体人类患者体内。移植的猪心脏在初始阶段表现出最佳功能；然而，两名患者均未存活超过两个月。涉及将器官或组织从一个物种移植到另一个物种的异种移植过程，其特点是免疫排斥相关的重大挑战。这些挑战包括超急性排斥反应、急性体液性异种移植排斥反应和急性细胞性排斥反应，这些可能特别棘手。此外，凝血和炎症反应紊乱已被观察到导致异种移植失败。尽管基因编辑和免疫抑制的组合能有效避免超急性排斥反应，但抗体介导的排斥反应会导致广泛的内皮损伤，阻碍猪心脏在患者体内的长期存活。与在异种动物中产生的人类心脏相比，转基因猪心脏的异种移植需要实施更严格的免疫抑制方案，并开发更灵敏的人畜共患病筛查和进展监测方法。
肾脏
将mPSCs注射到Sall1基因缺失的无肾大鼠囊胚中，发育出能够分泌尿液且肾生后肾间质来源于小鼠细胞的肾脏。然而，由于Sall1突变导致大鼠嗅球发育不全，这些嵌合体在出生后不久死亡。这一表型未被mPSCs挽救，导致无法正确进食。这项研究强调了优先选择对靶器官发育至关重要但不能影响正常胚胎发育的基因进行敲除的必要性。对非靶器官的潜在不利影响可以通过定位重组系统以实现时间或空间特异性条件性基因敲除来减轻。除肾生后肾间质外，集合管、输尿管、膀胱、血管和神经主要由宿主细胞组成。因此，选择由肾生后肾间质和输尿管芽表达且不干扰正常胚胎发育的基因是有利的。这些基因随后可以在条件性基因敲除大鼠模型中进行测试。相比之下，在Sall1基因缺失的无肾小鼠中未观察到rPSC来源的肾脏，这可能归因于大鼠细胞对小鼠肾生后肾间质的贡献不足。这一观察结果表明，在肾脏发育过程中，肾生后肾间质与输尿管芽相互作用所涉及的关键分子在小鼠和大鼠之间并不保守，或者可能是由于发育过程中细胞因子和细胞外基质等环境因素的不相容性。
肺
关于肺生成的研究主要集中在小鼠种内嵌合体。将mPSCs注射到Ctnnb1-KO、Fgfr2-KO、Fgf10突变或Nkx2-1突变的小鼠囊胚中，已被证明可以生成来源于供体细胞的肺上皮细胞，但间充质或内皮细胞是嵌合来源的。Fgfr2已被确定为有丝分裂信号传导的关键组分。最近的一项研究揭示，Foxa2表达最早始于中内胚层阶段，在肺上皮和间充质谱系的发育中起关键作用。一个显著的观察结果是，Foxa2启动子驱动的条件性Fgfr2基因缺失（Foxa2
Cre/+; Fgfr2
flox/flox）在小鼠模型中表现出去除肺发育的表型。这种现象对除胸腺外的其他重要器官影响很小。将mPSCs注射到这些小鼠的囊胚中，形成了包含来源于供体细胞的肺上皮、间充质和内皮细胞的肺，以及胸腺的发育。这些小鼠存活至成年，肺功能正常。因此，选择发育早期的器官发生基因进行条件性敲除可被认为是一个可行的选择。
在生成小鼠中的大鼠来源肺方面，Shunsuke等人采用了一种称为基于四倍体的器官补偿方法。该方法利用fgfr2缺陷小鼠胚胎中的rESC来源肺。值得注意的是，这些实验中的肺上皮细胞仅来源于大鼠，而间充质细胞是嵌合来源。然而，生成的肺表现出与正常肺不同的组织学特征，出生后无功能，导致嵌合小鼠在出生后平均13分钟内死亡。这种现象的根本原因归因于大鼠胚胎发育速度慢于小鼠。此外，即使在小鼠体内生成，大鼠来源的肺上皮细胞仍维持其自身的发育速率。因此，这些大鼠来源的肺上皮细胞在嵌合小鼠出生时仍处于不成熟状态，随后导致肺功能障碍。要在种间嵌合体中生成功能性肺，必须克服物种特异性的内在发育时间挑战。
肝脏
在最近的一项研究中，Huang及其同事将mESCs注射到未经基因编辑的大鼠囊胚中。从小鼠-大鼠嵌合体的肝脏中分离出mESC来源的肝细胞。这些细胞表现出成熟的肝功能，并能够减轻小鼠中由慢性肝损伤引起的慢性肝纤维化。这些发现表明，这种使用种间囊胚补偿的方法可以作为肝细胞的来源。与在异种动物体内原位扩增原代人肝细胞相比，这种方法具有不受原代肝细胞供应限制且仅需少量PSCs即可生成肝细胞的优势。然而，由于没有对大鼠囊胚进行基因编辑以清空生态位，嵌合肝脏中mESC来源细胞的比例约为15%，在扩增倍数方面低于小鼠体内原代人肝细胞的扩增。
相比之下，利用基于细胞或组织的疗法进行肝脏修复有可能作为肝移植的替代方案。肝类器官移植已在肝损伤模型中显示出修复能力。来源于原代人肝细胞、成体干/祖细胞或PSCs的肝类器官已被证明在移植到肝损伤小鼠模型后可植入并发挥作用。Sampaziotis及其同事首次证明了胆囊类器官在人肝脏中的再生潜力。研究人员将胆囊类器官注射到患有缺血性胆管损伤的已故人类供体肝脏的肝内胆管中。随后进行体外常温灌注。移植的类器官被发现植入肝内胆管树，增加了胆汁产生和胆汁pH值，表明胆管功能恢复。这种方法有可能在移植前增强供体肝脏的功能，从而增加符合移植标准的供体肝脏数量。除了移植，将肝类器官整合到生物人工肝装置中可以为急性肝衰竭患者提供临时支持。此外，将肝类器官接种到脱细胞肝脏基质中已被证明可以重建肝脏样结构，表现出区室化、胆管生成和血管化等特征。然而，这些类器官在移植环境中的临床适用性仍有待充分阐明。与利用异种动物生成人类肝脏相比，体外方法具有明显优势，包括技术相对成熟和所需时间较少。然而，体外方法受到缺乏广泛接受的标准化生成方案的阻碍，这阻碍了其可扩展性。此外，这些方法在维持强大的肝功能和体内长期存活方面面临挑战。
对于终末期肝衰竭患者，肝移植是当前的标准治疗方法。利用基因编辑的猪进行肝脏移植有可能解决肝脏供体短缺的问题。迄今为止，已在一名活体患者中进行了一项部分肝脏异种移植试验，其中移植的基因编辑小型猪肝脏表现出胆汁分泌能力，且肝动脉、门静脉和肝静脉血流正常。与在异种动物中生成的肝脏相比，基因编辑的小型猪肝脏更容易获得。然而，猪肝脏异种移植后仍存在血小板减少和凝血功能障碍等并发症。这种现象可归因于猪血管性血友病因子与人血小板的强结合以及随后肝窦内皮细胞和Kupffer细胞对血小板的摄取。
血管
除了器官短缺之外，移植后发生的免疫排斥反应是实施器官移植治疗的另一个限制因素。在器官移植中，供体和受体血管内皮细胞之间的主要组织相容性复合体（MHC）不匹配可导致超急性排斥反应和急性排斥反应。目前，虽然通过囊胚补偿在小鼠中生成的器官中的实质细胞来源于供体细胞，但基质和内皮细胞是嵌合来源的。为了最大限度地减少由生成器官引起的免疫排斥反应，实质细胞和血管内皮细胞都必须完全来源于供体细胞。
在啮齿动物中，已经进行了一些关于通过囊胚补偿单独生成血管内皮细胞的研究。通过在Flk1突变和Etv2缺失的小鼠中进行种内囊胚补偿，获得了完全来源于mESCs的血管内皮细胞和造血细胞。此外，Flk1突变小鼠也被用于种间囊胚补偿，确定E10.5嵌合体的血管内皮细胞完全来源于rESCs。此外，已观察到大鼠来源的造血干细胞（HSCs）分化为淋巴细胞和髓系细胞。然而，Flk1缺陷小鼠仅创建了血管内皮细胞和造血细胞的生态位，而非血管支持细胞。种间差异已被确定为可能阻碍大鼠血管内皮细胞与小鼠血管支持细胞之间正常通讯的因素，从而阻碍小鼠血管支持细胞的募集以形成成熟的大鼠血管。这种不相容性导致嵌合小鼠胚胎发育停滞在约E10.5。
在啮齿动物中，同时生成来源于供体细胞的器官实质和血管内皮细胞目前仅在小鼠中实现。这是通过选择性细胞消融实现的，通过种内囊胚补偿同时形成心脏和血管生态位。然而，当注射rESCs试图生成种间嵌合体时，发现E10.5嵌合体生长明显迟缓，且没有补偿迹象，这与之前关于血管内皮细胞的独立种间嵌合研究一致。需要进一步研究探索大鼠和小鼠之间血管正常发育的种间屏障，并确定具体的分子参与者。
血细胞
通过囊胚补偿过程利用异种动物中的人类PSCs获取红细胞或其他免疫细胞，在解决血液供应不足和排斥的关键问题方面具有相当大的前景。先前已在小鼠中生成了功能性大鼠胸腺。Wen等人将mESCs注射到正常大鼠囊胚中，在出生后第10天的嵌合体中检测到15-50%的骨髓细胞来源于mESCs。此外，mESCs具有分化为HSCs、淋巴样引发的多能祖细胞、共同髓系祖细胞以及产生红系、髓系和中性粒细胞祖细胞的能力。值得注意的是，将mESC来源的骨髓细胞移植到致死剂量照射的纯合小鼠中避免了其死亡，并且这些细胞对其骨髓和血液表现出持久而有效的贡献。这一发现强调了小鼠来源骨髓细胞的功能完整性。在一项开创性研究中，研究人员利用大鼠胚胎作为生物反应器，成功生成了完全功能性、来源于mESCs的骨髓。这两项研究的结果表明，分布于器官周围的血液细胞可以由嵌合性质的细胞组成，从而表明来源于异种细胞的血液细胞可以有效地发挥功能。此外，已有证据表明hiPSCs通过囊胚补偿在小鼠模型中能够分化为CD34
+血祖细胞。Hu及其同事将瞬时抑制mTOR的初始态hiPSCs注射到小鼠囊胚中。研究人员在小鼠出生后的骨髓和肝脏中发现了人CD34
+造血干细胞和人造血龛细胞。此外，Zhu等人利用基因编辑增强hiPSCs的嵌合能力。他们将过表达MYCN和BCL2基因的hiPSCs注射到Flk1突变小鼠囊胚中。通过FACS从嵌合体中获得了人CD34
+血祖细胞，这些细胞可以进一步分化为各种亚型的血细胞。所有这些研究为通过在异种动物（尤其是猪）中进行囊胚补偿获得人类血细胞开辟了可能性。
生殖细胞和神经细胞
人类种间嵌合体领域中一个特别有争议的问题涉及对可能诱发动物的遗传组成和认知功能改变的担忧，这些动物已被工程化改造含有人类生殖细胞和智能。因此，对生殖细胞和神经细胞进行囊胚补偿的深入研究具有巨大潜力。这将有助于研究发育机制在生命系统中的运作方式。此外，它可以为解决围绕hPSCs在异种动物中对人类生殖系统和大脑发育贡献的伦理问题提供一个关键框架。
已通过种内囊胚补偿在Nanos3-KO小鼠和Prdm14缺失的大鼠中成功生成了可育配子。这些嵌合体已被证明是一种以高效率生成突变后代的可行方法。例如，通过用Pax2/Pax8双突变ESCs补充Prdm14缺失的大鼠囊胚产生的嵌合体中，所有配子均表现出Pax2/Pax8双突变表型。因此，它们的杂交后代均为Pax2/Pax8双突变体，并表现出肾脏发育不全的表型。关于生殖细胞的种间囊胚补偿，Honda等人利用濒危琉球棘鼠（Tokudaia osimensis）的iPSCs在小鼠中生成了配子。Kobayashi等人成功地在Prdm14缺失的大鼠中生成了mESC来源的精子。这些精子能够在体外使小鼠卵母细胞受精并产生正常后代。总之，通过囊胚补偿生成的生殖系可用于高效地创建具有所需性状的动物，并获得濒危和灭绝物种的生殖细胞。
最终发育为皮层和海马体的背侧端脑祖细胞表达Emx1。在他们的研究中，Chang等人采用了一种称为Emx1-Cre; R26-DTA靶向细胞消融的方法来获得前脑生态位，并通过种内囊胚补偿获得了mESC来源的完整前脑。关于适合基于敲除的前脑囊胚补偿的基因，Wu及其同事开创了基于C-CRISPR的囊胚补偿方法。该方法旨在快速筛选和鉴定Hesx1基因。将靶向Hesx1启动子的四个gRNAs与Cas9 mRNA共微注射到受精卵中，已证明可在小鼠中生成前脑生态位。此外，将rESCs注射到Hesx1-KO小鼠囊胚中，已产生前脑嵌合效率为90-100%的早期发育胚胎。然而，到E15.5时，小鼠前脑中的大鼠嵌合水平降至60%，表明大鼠和小鼠在妊娠中晚期存在种间屏障。
大型动物中异种组织和器官的生成
牛和猪物种以其大型有蹄附属物而著称。利用牛作为生物反应器生成人体组织或器官具有几个明显优势。首先，牛的妊娠期与人类相似，因此与猪胚胎相比，有助于人源化嵌合器官在体内环境中完全发育和成熟。此外，人类与牛的四肢骨骼和肌肉的尺寸兼容性优于猪。在上述研究中，研究人员将hiPSCs注射到牛和猪的囊胚中，以评估它们对种间嵌合内细胞团（ICM）的贡献。结果表明，注射到牛胚胎中的初始态和形成态hiPSCs的嵌合效率高于猪胚胎。这一发现阐明了猪和牛囊胚环境之间的差异，表明牛囊胚可能为hiPSCs的整合和存活提供更有利的环境。然而，与猪相比，牛的窝产仔数相对较低，加上其成本效益，仍然是一个突出的问题。迄今为止，在牛中只有一例囊胚补偿应用的记录，其中通过种内囊胚补偿在具有卵巢生殖细胞缺陷的NANOS3缺失牛胚胎中观察到含有供体卵裂球来源生殖细胞的嵌合卵巢。牛种间囊胚补偿研究的缺乏表明存在持续的种间嵌合屏障，需要进一步研究。
进化距离诱导的发育不相容性，也称为种间屏障，已被证明阻碍嵌合体的形成。非人灵长类动物（NHPs）在遗传学、发育、生理学和行为特征方面与人类表现出显著的相似性。NHP与人类之间的胚胎发育差异很小，种间屏障基本不存在。将NHPs用作嵌合体宿主与其他物种相比，减少了促进细胞整合和分化的生长因子配体、受体、细胞粘附分子和其他调节因子的物种特异性差异。然而，NHPs不如其他物种丰富，其使用在劳动力和成本方面构成更大的挑战，并且伦理审查更严格。目前，人-猴嵌合胚胎的形成仅在体外实现。将人类扩展多能干细胞（EPSCs）显微注射到早期食蟹猴囊胚中，随后体外培养至原肠胚阶段。人EPSCs对上胚层有显著贡献（受精后第15天贡献率最高达7.08%），但对下胚层贡献相对较少（受精后第19天贡献率最高达4.96%）。统计上，人类细胞在食蟹猴胚胎中的嵌合效率约为4%，显著高于先前人-猪嵌合胚胎中观察到的1/100,000的比率。最近，食蟹猴ESC和嵌合胚胎的培养条件得到优化，成功诞生了具有高比例猴ESC贡献的嵌合猴。在出生后嵌合猴的26个不同组织中，供体细胞的贡献率从21%到92%不等，平均为67%。这为人类-猴嵌
