《Plants》：Functional Roles of Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Plant Growth-Promoting Rhizobacteria in Pistachio: Implications for Stress Tolerance, Nutrient Acquisition and Disease Suppression
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叶片衰老是一个高度程序化的发育过程，使植物能够实现养分从源器官到库器官的再动员。叶绿体作为植物体内主要的氮素储存库，其组成蛋白的及时降解对于维持籽粒灌浆和作物产量至关重要。为了实现高效的氮素循环利用，叶绿体蛋白质组必须通过细胞器内外协同作用的蛋白水解途径，以受
叶片衰老是一个高度程序化的发育过程，使植物能够实现养分从源器官到库器官的再动员。叶绿体作为植物体内主要的氮素储存库，其组成蛋白的及时降解对于维持籽粒灌浆和作物产量至关重要。为了实现高效的氮素循环利用，叶绿体蛋白质组必须通过细胞器内外协同作用的蛋白水解途径，以受控的方式进行拆卸。在衰老过程中，蛋白质丰度通过降解作用与抑制新合成的平衡而逐渐降低，这一过程取决于植物的碳–氮状态。功能失常或受损的叶绿体组分被选择性清除。迄今为止，已鉴定出三大类叶绿体蛋白降解系统：细胞质泛素–蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)、液泡降解途径以及叶绿体内部蛋白酶。本文对这三种叶绿体蛋白降解机制进行了全面的最新综述，并讨论了它们在氮素再利用中的协同作用。研究人员还探讨了如何对这些途径进行调控以提升氮利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)和作物生产力。
1. 引言
叶片衰老是由时序年龄或环境胁迫触发的一个受遗传程序调控的末端发育阶段，通过衰老相关基因(senescence-associated genes, SAGs)控制的程序性细胞死亡机制，将养分从源器官主动再动员至库器官，对籽粒灌浆和生物量积累至关重要。叶绿体蛋白占叶片总蛋白的70%以上，在C
3植物中叶绿体氮约占叶片总氮的75%–80%，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是叶绿体中最丰富的基质蛋白，约占可溶性叶片蛋白的50%和总氮的20%–30%。因此，衰老过程中叶绿体蛋白组分的降解是植物养分回收再利用的主要来源。
2. UPS介导的叶绿体蛋白降解
泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是植物体内选择性蛋白降解的快速调控机制，包括靶蛋白泛素化、26S蛋白酶体识别及最终降解，其中E3连接酶的多样性显著扩展了底物特异性。目前已在叶绿体上鉴定出两种由E3连接酶SP1和PUB4介导的泛素依赖性降解途径。
2.1 SP1
SP1定位于叶绿体外被膜，可与多种TOC复合体蛋白直接互作并介导其泛素化，进而靶向26S蛋白酶体降解，从而调控叶绿体前体蛋白的输入。在胁迫条件下，SP1通过抑制光合作用减少活性氧(reactive oxygen species, ROS)过量产生和光氧化损伤。SP1还与SP2、CDC48协同构成叶绿体相关蛋白降解(CHLORAD)途径，实现泛素化TOC蛋白从外被膜到细胞质的逆转位降解。此外，TOC组分还可发生K63连接的多元泛素化，并被选择性自噬受体NBR1识别后经巨自噬途径递送至液泡降解，K48连接链与K63连接链的差异为UPS与自噬之间的路径选择提供了分子基础。
2.2 PUB4
PUB4是细胞质E3连接酶，在铁螯合酶2(ferrochelatase 2, FC2)突变导致四吡咯途径紊乱并引发叶绿体内ROS过量积累时，PUB4可对叶绿体外膜蛋白进行广泛泛素化，进而通过未知机制触发受损叶绿体向液泡的清除。但目前仍缺乏PUB4泛素化底物直接为外被膜蛋白的证据，其具体作用机制尚待阐明。
3. 叶绿体蛋白的液泡降解途径
液泡是植物细胞中最大的水解区室，是叶绿体蛋白降解和氮素循环的关键场所。已知存在自噬依赖和自噬非依赖两大类途径可将叶绿体蛋白递送至液泡降解。
3.1 自噬依赖性降解途径
3.1.1 RCB途径
含Rubisco小体(Rubisco-containing body, RCB)途径最初在小麦叶片细胞质和液泡中观察到，RCB是自噬体样双层膜包裹Rubisco形成的小球体，其形成受叶片碳状态而非氮状态的负调控。在碳饥饿条件下，植物通过增强RCB介导的蛋白降解产生氨基酸以维持呼吸和能量消耗，该途径是衰老过程中将叶绿体基质蛋白尤其是Rubisco导入氨基酸代谢的重要方式。
3.1.2 ATI-PS途径
ATI-PS途径是ATI介导、ATG8依赖的胁迫诱导型选择性自噬途径，在碳饥饿、盐胁迫和暗处理条件下被激活。ATI1是定位于叶绿体外膜的单次跨膜蛋白，通过ATG8互作基序与ATG8直接结合，在营养饥饿时于叶绿体表面组装形成ATI-PS小体并被递送至中央液泡降解。ATI1缺失虽不影响Rubisco稳定性，但导致叶绿体过氧化物氧还蛋白A(PrxA)显著积累，表明其作为特定叶绿体蛋白选择性周转的受体发挥作用。
3.1.3 叶绿体自噬
叶绿体自噬(Chlorophagy)是自噬体将整个受损或衰老叶绿体包被并递送至液泡完全降解的选择性自噬过程。UV-B照射导致叶绿体积累大量ROS时，ATG8标记的自噬体捕获整个叶绿体。近年发现叶绿体自噬也可通过微自噬发生：液泡膜直接内陷包裹受损叶绿体，该过程依赖泛素结合自噬受体NBR1，但不依赖ATG7和ATG8脂化，且NBR1可分布于叶绿体表面及内部，对传统自噬受体仅定位于细胞器表面的观点提出挑战。
3.2 自噬活性的调控：TOR-SnRK1信号轴
雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin, TOR)是自噬的负调控因子，Snf1相关蛋白激酶1(Snf1-related protein kinase 1, SnRK1)是正调控因子，二者通过整合碳/氮代谢与糖信号协同调控自噬和氮素循环。
3.2.1 TOR信号通路
TOR通过保守的TOR信号(TOS)基序直接磷酸化ATG13以维持自噬抑制状态；营养缺乏时，TOR失活解除对ATG13的磷酸化，I型蛋白磷酸酶(TOPP)使ATG13去磷酸化，促进ATG1-ATG13复合体形成并激活自噬。TOR-RNAi拟南芥表现早衰表型，而TOR过表达可延缓年龄依赖性衰老。
3.2.2 SnRK1信号通路
SnRK1在暗处理和营养饥饿等衰老诱导条件下被激活，可激活ATG1激酶复合体并抑制TOR以促进自噬；长期碳饥饿时，SnRK1的催化亚基KIN10可直接磷酸化磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)亚基ATG6，通过绕过ATG1的替代途径激活自噬。FLZ(FCS-like锌指)蛋白作为SnRK1与TOR信号的整合因子，在能量胁迫下经ATG8介导的自噬被快速降解，解除对SnRK1的抑制并形成正反馈调节环。
3.3 自噬非依赖的液泡途径
衰老相关液泡(senescence-associated vacuole, SAV)途径中，SAV是非液泡起源的酸性小囊泡，具强半胱氨酸蛋白酶活性，典型标志物为衰老标记基因SAG12。SAV含有Rubisco和谷氨酰胺合成酶2(GS2)等基质蛋白，在暗诱导衰老中介导Rubisco的部分降解。叶绿体囊泡化(chloroplast vesiculation, CV)途径的关键蛋白CV定位于叶绿体被膜和类囊体膜，通过其C端结构域与类囊体蛋白互作形成CV包被囊泡(CCV)，将叶绿体蛋白递送至液泡降解。CV诱导表达加速拟南芥和番茄衰老，而CV敲除延缓衰老并改善番茄果实品质。
4. 叶绿体内部蛋白酶系统
4.1 Clp
酪蛋白裂解蛋白酶(caseinolytic protease, Clp)是ATP依赖性丝氨酸蛋白酶，由十四亚基蛋白水解核心复合体和伴侣亚基组成，定位于基质和内膜，主要负责基质蛋白的质量控制。clpc1-1缺失突变体表现严重早衰和持续淡绿表型。共表达网络分析显示Clp核心亚基(ClpPRT、ClpD、ClpF)直接参与衰老叶绿体的识别、蛋白降解和细胞器清除。
4.2 FtsH
丝状温度敏感蛋白H(filamentation temperature-sensitive H, FtsH)是ATP依赖性金属蛋白酶，定位于类囊体膜，以FtsH1、FtsH2、FtsH5和FtsH8组成的异源六聚体形式发挥功能，降解光损伤的PSII核心亚基D1和捕光色素蛋白复合体等类囊体组分。FtsH2与自噬核心蛋白ATG8a直接互作，协调叶绿体分裂与降解，为叶绿体内部蛋白酶与液泡降解途径之间的互作提供了首个分子证据。
4.3 Deg
Deg蛋白酶属于Deg/HtrA家族，是ATP非依赖性丝氨酸蛋白酶。拟南芥叶绿体至少含有五种Deg蛋白酶，其中Deg1、Deg5和Deg8定位于类囊体腔，Deg2定位于类囊体膜基质侧，Deg7定位于基质。Deg5和Deg8形成六聚体协同降解光损伤的D1蛋白，Deg7通过对光损伤D1、D2、CP47和CP43的初始切割直接参与PSII修复。
4.4 CND41
CND41是叶绿体定位的天冬氨酰蛋白酶，具有DNA结合活性，在酸性条件(pH 2–4)下表现强蛋白水解活性，可降解变性Rubisco。CND41表达下调的烟草在衰老期间保持绿叶和较高Rubisco含量，而过表达则加速衰老并促进Rubisco降解。
5. 衰老过程中蛋白水解途径的协同
三大蛋白水解系统并非孤立运作，而是构成时空整合的调控网络。UPS尤其是SP1-CHLORAD途径可能在衰老早期限制新合成光合蛋白向叶绿体的输入；随着衰老推进，自噬通过RCB、ATI-PS小体和整叶绿体自噬成为大量氮素回收的主要途径；后期叶绿体内部蛋白酶及SAV、CV等途径微调残余蛋白降解并参与局部氨基酸循环。各途径在时间上可能重叠，其相对重要性因物种、发育阶段和环境条件而异。TOR-SnRK1营养感知网络在这一协调过程中发挥核心调控作用。
6. 从机制到作物氮利用效率：将叶绿体蛋白水解转化为农艺增益
6.1 增强自噬以直接回收氮素
自噬是植物大量氮素输出的主要途径。拟南芥atg5和atg7突变体氮再利用缺陷，低氮条件下自噬贡献高达60%的叶片到籽粒的氮转运。过表达ATG7或ATG8可增强氮素再动员和籽粒产量，但组成型自噬过度激活会加速早衰，因此可采用SAG12等衰老诱导型启动子将增强的自噬通量限制在衰老叶片中。
6.2 通过UPS和自噬非依赖途径调节衰老时
