单细胞转录组图谱揭示新生儿败血症的免疫全景

《Cell Reports》：A single-cell transcriptomic atlas reveals the immune panorama of neonatal sepsis

　　

新生儿败血症仍然是婴儿死亡的主要原因，但其同时发生的高炎症（hyperinflammation）和免疫抑制（immunosuppression）的机制尚不清楚。在此，研究人员对来自18名新生儿的26份血液样本（涵盖急性败血症（acute sepsis）、恢复期（convalescence）和健康对照（healthy controls））进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。研究人员识别出57个细胞亚型，揭示了急性期淋巴样细胞耗竭（lymphoid depletion）和髓样细胞扩增（myeloid expansion）。S100A8⁺ 髓源性抑制细胞样（myeloid-derived suppressor cell-like, MDSC-like）细胞代表了一个推定的细胞因子风暴（cytokine storm）来源，可能通过一个前馈性的S100–TLR4–MYD88回路（circuit）放大。天然样淋巴细胞（Innate-like lymphocytes）未能扩增，尽管细胞毒性（cytotoxicity）增强，但走向凋亡（apoptosis）和耗竭（exhaustion）。CD4⁺ T细胞显示线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction），而调节性T细胞（regulatory T cells）通过LGALS9–HAVCR2轴获得超抑制表型（hyper-suppressive phenotype）。CD8⁺ T细胞在进入耗竭前经历干扰素驱动的、天然样重编程（innate-like reprogramming），B细胞转向应激适应、耐受性状态（stress-adaptive, tolerogenic states）。总之，该图谱定义了一种双重病理（dual pathology），其中MDSC样细胞驱动的细胞因子风暴与多谱系免疫麻痹（multi-lineage immunoparalysis）共存，将S100–TLR4轴和线粒体失调（mitochondrial dysregulation）列为潜在治疗靶点。

**新生儿败血症免疫机制的单细胞转录组图谱解读**

**研究背景与问题**
新生儿败血症（neonatal sepsis）仍是全球婴儿死亡的主要原因之一，尤其在早产儿中发病率高，在低收入和中等收入国家（low- and middle-income countries, LMICs）尤为严重。该疾病不仅导致急性期多器官衰竭和死亡，幸存者还可能面临脑瘫、神经发育迟缓等长期后遗症。新生儿免疫系统的不成熟是其易感性高的核心原因，但保护性及致病性免疫机制，特别是严重疾病的免疫和分子驱动因素，尚不明确。因此，亟需系统解析新生儿败血症中免疫反应的动态变化，以识别关键的炎症通路、免疫细胞表型和免疫病理机制，为改善临床结局提供理论基础。

**研究内容与结论**
该研究发表于《Cell Reports》。研究人员对18名新生儿的26份外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）样本（包括急性败血症期12份、恢复期8份及健康对照6份）进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），构建了高分辨率的新生儿败血症免疫图谱。通过整合转录组学数据与临床及实验室参数，研究揭示了疾病进展中深刻的免疫重塑。核心结论包括：急性期以淋巴样细胞耗竭和髓样细胞扩增为特征；S100A8⁺ 髓源性抑制细胞样（myeloid-derived suppressor cell-like, MDSC-like）细胞是细胞因子风暴（cytokine storm）的主要来源，可能通过S100–TLR4–MYD88前馈回路（feedforward circuit）被放大；天然样淋巴细胞（innate-like lymphocytes）因凋亡（apoptosis）和耗竭（exhaustion）而无法扩增；CD4⁺ T细胞存在线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction），调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）通过LGALS9–HAVCR2轴获得超抑制表型（hyper-suppressive phenotype）；CD8⁺ T细胞经历干扰素驱动的天然样重编程（innate-like reprogramming）后陷入耗竭；B细胞转向应激适应、耐受性（stress-adaptive, tolerogenic）状态。该图谱定义了MDSC样细胞驱动的细胞因子风暴与多谱系免疫麻痹（multi-lineage immunoparalysis）共存的“双重病理”，并提名S100–TLR4轴和线粒体失调作为潜在治疗靶点。

**主要技术方法**
1. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：采用10× Genomics平台对18名新生儿的26份PBMC样本（包括急性败血症期12份、恢复期8份及健康对照6份，均来自首都儿科研究所附属儿童医院）进行测序，通过生物信息学流程（kallisto/bustools、Scanpy、Harmony）进行数据质控、整合、聚类和注释。
2. **生物信息学分析**：运用Louvain算法进行细胞聚类，结合典型标记基因和差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）进行亚型注释；使用扩散伪时间（diffusion pseudotime）和基于划分的图抽象（partition-based graph abstraction, PAGA）推断细胞轨迹；采用CellPhoneDB进行配体-受体（ligand-receptor）相互作用分析。
3. **血浆蛋白与流式验证**：通过ELISA试剂盒（Ruixin Biotechnology）定量检测血浆中S100A8/A9复合物、S100A12和CXCL8（IL-8）的蛋白浓度；利用流式细胞术（BD LSRFortessa）验证关键细胞表面标志物（如PD-1、TIM-3、LAG-3、CTLA-4）的表达。

**研究结果**

**1. 新生儿败血症的单细胞分辨率免疫景观**
通过对18名新生儿的26份PBMC样本进行scRNA-seq，在质控后保留293,450个高质量细胞，鉴定出14个主要免疫细胞类型，并进一步细分为57个细胞亚型。急性败血症期（acute sepsis, AC）显示淋巴样细胞（B细胞、CD4⁺ T、CD8⁺ T、γδ T细胞）比例降低，而髓样细胞（特别是单核细胞和S100A8⁺ MDSC样细胞）比例升高，且该变化在恢复期（convalescence, CO）未完全逆转。这一发现通过RO/E分析和临床全血细胞计数得到验证，表明新生儿败血症的特征是急性期淋巴样细胞耗竭和髓样细胞扩增。

**2. 不同的高炎症谱系协调急性新生儿败血症的细胞因子风暴**
通过细胞因子和炎症基因集评分，研究识别出8个高炎症细胞亚型，其中S100A8⁺ MDSC样细胞（MO_06_MDSC）贡献了约86%的炎症评分和约92%的细胞因子评分。S100A8/A9/A12是排名前三的细胞因子，贡献超过90%的细胞因子评分。血浆蛋白水平也证实了S100A8/A9、S100A12和CXCL8在急性期显著升高。S100蛋白可能通过TLR4–MYD88通路形成正反馈回路，而CXCL8–CXCR1/2信号可能参与MDSC样细胞的招募和激活。配体-受体分析显示，高炎症亚型之间存在密集的相互作用网络，以LMPCs、mDC和MO_08_Dividing为中心，通过TNF–TNFR、TGF-β、IL-1–IL-1R和趋化因子信号协调炎症网络的放大。

**3. 应激反应性单核细胞和MDSC样细胞主导急性新生儿败血症的髓样反应**
对髓样细胞进行再聚类，鉴定出14个亚型，包括8个单核细胞亚型。PAGA和扩散伪时间分析显示，单核细胞从经典、活化、应激反应性亚型向中间单核细胞和MDSC样细胞转变。MDSC样细胞（MO_06）表现出典型的CD14⁺ HLA-DR^-/low表型，共表达S100A8/A9/A12，并高表达免疫调节基因（ARG1、IDO1、CD274、TGFB1、VSIR等），通过配体-受体作用（如PD-L1–PD-1、TGF-β1–TGFBR1、LGALS9–HAVCR2）抑制T细胞和NK细胞功能。早期单核细胞（MO_01–04）在急性期同时表达促炎基因（S100A8/9/12）和免疫耐受相关基因（HAVCR2、CD274、PPARG等），表明免疫抑制程序在炎症激活初期即已启动。恢复期，这些单核细胞恢复抗原呈递和杀菌功能。MO_07_Stress亚群在急性期特异性出现，表现出强烈的IFN反应、应激基因诱导和颗粒细胞样特征，参与早期抗菌效应。此外，还鉴定出两个中性粒细胞亚群（Neu_01_Immature和Neu_02_Mature），急性期Neu_01显示NETosis相关基因（PADI4、MPO、ELANE、GSDMD）上调，而Neu_02表现出缺氧驱动的代谢重编程和MDSC样特征。

**4. 耗竭和凋亡限制天然样细胞毒性淋巴细胞反应**
天然样淋巴细胞（NK、NKT、γδ T细胞）在急性期上调了细胞毒性基因（PRF1、GNLY、NKG7、GZMA/B/H）和炎症基因（S100A6/8/9/11、CASP1、CCL3），并诱导HLA-II类分子表达，提示其获得抗原呈递能力。然而，这些细胞未能扩增，反而表现出显著升高的耗竭评分（上调解毒受体PDCD1、LAG3、CTLA4等）和凋亡评分（上调FAS、XAF1、CASP1/7等），表明其激活与扩增能力脱钩，这一矛盾现象构成了新生儿细胞毒性细胞区室的关键脆弱性。

**5. 谱系特异性重编程和代谢失调是新生儿败血症CD4⁺ T细胞病理的特征**
CD4⁺ T细胞分为14个亚型，包括3个初始亚型、记忆亚型、Treg亚型、Th1亚型和活化亚型。急性期，所有初始亚型均被耗竭。Treg细胞（CD4_09/10）在急性期比例下降，其中活化Treg（CD4_10）上调了效应调节因子（IRF7、IRF4、BATF、MAF）和抑制性检查点（ICOS、TNFRSF18、LAG3、CTLA4、HAVCR2），并通过LGALS9–HAVCR2、TGF-β1–TGFBR1等与单核细胞、NK细胞和CD8⁺ T细胞形成免疫调节网络。同时，Treg细胞表现出Th1样炎症重塑（上调TBX21、CXCR3、HIF1A）和FOXP3表达下调，提示其谱系稳定性受损。Th1细胞在急性期扩增，表现出强烈的IFN驱动抗菌效应状态，但伴随线粒体功能障碍（下调氧化磷酸化和电子传递链基因）。恢复期，Th1细胞重新激活线粒体氧化磷酸化，恢复生物能学适应能力。记忆CD4⁺ T细胞在急性期严重耗竭，且恢复不完全，预示长期免疫缺陷风险。

**6. 干扰素驱动的耗竭和天然样重编程是CD8⁺ T细胞反应的特征**
CD8⁺ T细胞分为10个亚型。急性期，CD8⁺ T细胞整体耗竭，但CD8_10_Effector_ISG15_MX1亚型选择性扩增，表明存在聚焦的IFN-I驱动细胞毒性反应。伪时间分析显示，初始CD8⁺ T细胞向天然样效应细胞（CD8_06/07/09）分化。耗竭评分在CD8_03/04_eMemory、CD8_05_Dividing和CD8_10_Effector中显著升高，伴随上调LAG3、HAVCR2、KLRG1、CTLA4等耗竭相关基因，以及PRDM1、PTPN6、PTPN11等调节因子。这些耗竭亚型同时保留强大的细胞毒性程序（PRF1、NKG7、GZMB），形成“耗竭却具细胞毒性”的适应性不良状态，可能导致病原体清除障碍和组织损伤。天然样效应CD8⁺ T细胞（CD8_06/07/08/09）在急性期上调了153个差异表达基因，包括ISGs（IFITM1、IFITM2、ISG20、IRF1）和炎症介质（S100A8/9、JUNB、FOS），恢复期则下调了干扰素驱动的激活程序。

**7. 应激适应重编程和耐受性定义新生儿败血症的B细胞反应**
B细胞分为8个亚型。急性期，B细胞（包括浆细胞）严重耗竭，浆细胞区室以未转换的IgM⁺/IgD⁺表型为主，但存在轻微的同种型转换迹象。B细胞经历广泛的转录重编程，表现为IFN和应激反应增强（ISGs、STAT1、IRF1、S100A8/9），但核心B细胞受体（BCR）成分（CD79A/B、CD40、PTPRC）和近端激酶LYN被抑制，同时上调MHC-I/II类分子和抗原加工机制，提示其从抗原驱动激活转向抗原呈递表型。B细胞还上调非经典MHC-I类分子（HLA-E/F/G），可能通过抑制性受体（如NKG2A、LILRB1）保护自身免受NK细胞介导的杀伤，但此举也强化了耐受性环境。恢复期，B细胞下调应激状态，恢复免疫球蛋白组装基因表达，提示体液分化功能部分恢复。

**讨论与结论**
讨论部分强调，该研究构建的高分辨率单细胞图谱揭示了新生儿败血症的双重病理：MDSC样细胞驱动的细胞因子风暴（通过S100–TLR4–MYD88前馈回路放大）与多谱系免疫麻痹（包括T细胞耗竭、代谢障碍、B细胞耐受性重编程）共存。这种高炎症与免疫缺陷并存的复杂病理挑战了非特异性治疗策略，并揭示了S100–TLR4轴和线粒体代谢检查点作为精准治疗靶点的潜力。研究结论指出，新生儿败血症的急性期免疫状态在恢复期并未完全恢复正常，而是进入一个独特的“败血症后过渡状态”，表现为炎症和抑制性髓样程序的减弱、单核细胞功能的部分恢复以及淋巴样细胞向分化和代谢适应的重编程，但持续的免疫失衡（如单核细胞和淋巴细胞比例异常）表明恢复期仍存在免疫易感窗口期。因此，免疫监测和干预应延伸至临床治愈之后。