肌动蛋白的形态和功能影响着其健康状态及老化过程

《iScience》：Form and function of actin impacts actin health and aging

　　亮点
- 改变肌动蛋白结构会加速组织中的衰老现象
- 改变肌动蛋白结构会导致与早衰相关的转录组变化
- 药物介导的肌动蛋白稳定可以延长寿命，而其不稳定则会缩短寿命
- 人类ACTB变异与年龄相关的步速下降有关

摘要
肌动蛋白细胞骨架是一种基本且高度保守的结构，参与多种细胞过程，但其对生物体衰老的直接贡献仍不清楚。在这里，我们系统地研究了基因和药物对肌动蛋白结构和功能的干扰如何影响秀丽隐杆线虫的寿命和各种衰老特征。全身性和组织特异性的肌动蛋白及其关键结合蛋白（ABPs）——arx-2（Arp2/3）、unc-60（卷曲蛋白）和lev-11（原肌球蛋白）的敲除导致纤维组织过早紊乱、寿命缩短以及组织特异性的生理缺陷。肌动蛋白功能障碍还表现出更“衰老”的转录组特征，使用先前验证的转录组钟发现，这种变化广泛加剧了许多与年龄相关的现象，包括线粒体功能障碍、脂质调节紊乱、蛋白质稳态丧失、自噬功能受损以及肠道屏障功能失效。Latrunculin A引起的药物介导的不稳定作用与基因敲除效果相似，而Jasplakinolide的轻度稳定作用则适度延长了寿命，这强调了最佳和精细调节的肌动蛋白功能对健康衰老至关重要。最后，对人类全基因组关联数据的分析显示，常见的ACTB多态性与年龄相关的步速下降存在关联，表明在不同生物体中肌动蛋白与衰老之间存在某些联系。总体而言，我们的结果提供了一个全面且公开可用的资源，首次绘制了肌动蛋白完整性变化与组织中多种衰老现象之间的关系图谱。这一描述性框架旨在通过提供深入且无偏的数据集来促进未来的机制发现，这些数据集可以与新兴研究相结合，以定义肌动蛋白动态如何可能影响衰老过程。

图形摘要

引言
肌动蛋白细胞骨架是由蛋白质纤维组成的动态三维支架，对所有真核细胞的结构、功能和动态适应性至关重要。其进化上的保守性表明它在几乎所有单细胞和多细胞真核生物中的许多基本细胞过程中起着关键作用，包括细胞分裂、运动、细胞内运输和自噬。在生理层面上，肌动蛋白的完整性和动态性对于肌肉收缩、神经元可塑性、免疫反应、组织发育以及多细胞生物中的许多其他关键过程都是必需的。鉴于其在这些基本过程中的核心作用，精确调节肌动蛋白动态对于生物体健康至关重要，而其失调在许多人类疾病中均有发现，例如神经退行性疾病、癌症和肌肉肌病。然而，肌动蛋白细胞骨架在一般衰老病理学中的贡献才刚刚开始被理解。尽管肌动蛋白是由少数几个基因编码的蛋白质聚合物组成的（例如，在秀丽隐杆线虫中为ACT-1至ACT-5；在哺乳动物中为α、β和γ），但肌动蛋白细胞骨架能够在每种细胞类型和组织中形成具有截然不同功能的多种结构。肌动蛋白的功能多样性是由肌动蛋白结合蛋白（ABPs）协调的，这些蛋白负责组装、解组装和将肌动蛋白多蛋白复合体组织成能够驱动特定生物过程的高级结构。其中最重要的调节因子包括：Arp2/3复合体，它启动分支肌动蛋白网络从而促进细胞突起；卷曲蛋白，它切断纤维并促进肌动蛋白更新；形成蛋白，它们启动并延长线性肌动蛋白纤维；以及原肌球蛋白/原肌球蛋白原，它们稳定纤维并对肌肉功能至关重要。这些ABPs之间的相互作用使细胞能够根据不同的特定功能调整肌动蛋白细胞骨架的形式和动态，如肌肉收缩、肠道中的紧密连接和伤口愈合。然而，在整个生物体寿命期间，特别是在压力和衰老过程中，保持细胞骨架完整性和功能的机制尚未完全理解。

在模式生物中的研究表明，肌动蛋白稳态与衰老和长寿之间存在重要关系。在秀丽隐杆线虫中，衰老伴随着肌动蛋白纤维稳定性的逐渐下降。保持肌动蛋白完整性的干预措施，如过表达编码热休克转录因子HSF-1或溴结构域蛋白BET-1的基因，已被证明可以延长寿命和健康寿命，从而直接证明了肌动蛋白维持与生物体衰老之间的联系。例如，HSF-1可以上调肌动蛋白调控基因（如pat-10），从而发挥其延长寿命的作用。同样，BET-1通过转录上调肌动蛋白调控基因，从而增加肌动蛋白稳定性并延缓与年龄相关的肌动蛋白紊乱，进而延长寿命。在黑腹果蝇中，一项研究表明，大脑中与年龄相关的纤维状肌动蛋白（F-actin）积累会损害自噬功能，导致神经元功能障碍和认知能力下降。通过靶向形成蛋白样基因Fhos来减少这种F-actin积累可以恢复自噬并延长健康寿命。

在脊椎动物系统中，肌动蛋白功能障碍的后果在神经退行性疾病、肌肉功能障碍、免疫失调和癌症的背景下最为明显。肌动蛋白细胞骨架对于神经元发育、树突棘的形态形成以及学习和记忆背后的突触可塑性是必需的。异常的卷曲蛋白活性和卷曲蛋白-肌动蛋白杆的形成与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关。在免疫系统中，动态的肌动蛋白重排驱动免疫细胞迁移、吞噬作用以及T细胞激活和细胞毒性反应所需的免疫突触的形成。心血管健康也依赖于肌动蛋白的完整性，以维持内皮屏障功能和血管平滑肌的收缩能力，其中profilin-1等调节因子与高血压和动脉粥样硬化有关。此外，肌动蛋白细胞骨架还参与癌症进展，驱动细胞运动、侵袭和免疫逃逸。重要的是，衰老是所有这些与肌动蛋白相关疾病的主要风险因素，进一步证明了肌动蛋白与衰老之间的关联。

尽管肌动蛋白是由少数几个基因编码的蛋白质聚合物组成的（例如，在秀丽隐杆线虫中为ACT-1至ACT-5；在哺乳动物中为α、β和γ），但肌动蛋白细胞骨架能够在每种细胞类型和组织中创建具有不同功能的各种结构。肌动蛋白的功能多样性是由肌动蛋白结合蛋白（ABPs）协调的，这些蛋白负责组装、解组装和将肌动蛋白多蛋白复合体组织成能够驱动特定生物过程的高级结构。其中最重要的调节因子包括：Arp2/3复合体，它启动分支肌动蛋白网络；卷曲蛋白，它切断纤维并促进肌动蛋白更新；形成蛋白，它们启动并延长线性肌动蛋白纤维；以及原肌球蛋白/原肌球蛋白原，它们稳定纤维并对肌肉功能至关重要。这些ABPs之间的相互作用使细胞能够根据不同的特定功能调整肌动蛋白细胞骨架的形式和动态，如肌肉收缩、肠道中的紧密连接和伤口愈合。然而，在整个生物体寿命期间，特别是在应激和衰老过程中维持细胞骨架完整性和功能的机制尚未完全理解。

总之，我们的结果提供了一个全面且公开可用的资源，首次绘制了肌动蛋白完整性变化与组织中多种衰老现象之间的关系图谱。这一描述性框架旨在通过提供深入且无偏见的数据集来支持未来的机制发现，这些数据集可以与新兴研究相结合，以定义肌动蛋白动态如何可能影响衰老过程。总体而言，这些数据表明，RNAi敲低肌动蛋白或ABPs会可靠地导致衰老过程中肌动蛋白结构的过早破坏，尽管在不同组织中的程度有所不同。图1显示，ABPs的敲低会缩短寿命并加速肌动蛋白的破坏。图1显示，ABPs的敲低会缩短寿命并加速肌动蛋白的破坏。

全图说明：
图查看器：
(A–F) 表示从肠道特异性（gly-19p）(A)、表皮特异性（col-19p）(C)或肌肉特异性（myo-3p）启动子表达LifeAct:mRuby的成年动物的代表性荧光图像，以及(B)肠道、(D)表皮和(F)肌肉中肌动蛋白纤维破坏的定量结果。这些动物从孵化开始就分别接受了空载体（EV）、act-1:EV（10% act-1或20% act-1）的1:9或2:8混合物、arx-2、lev-11或unc-60 RNAi的处理。所有动物在成年后的第1天、第5天和第9天都进行了成像，成像设备分别为Leica Stellaris（肠道）或Leica Thunder Imager（表皮和肌肉）。刻度尺为10 μm。
(G) 对从孵化开始就接受EV（蓝色）、act-1:EV（10% act-1，黄色）、arx-2（红色）、lev-11（绿色）或unc-60（紫色） RNAi处理的N2动物进行了鞭打实验。记录是在M9溶液中进行的，鞭打行为在10秒的记录时间内手动评分。数据代表三次独立实验的结果。每种条件下有30–33条蠕虫。每个点代表一条单独的动物，线条代表中位数和四分位数范围。*** = p < 0.001（使用非参数Mann-Whitney检验计算）。
(H) 对从孵化开始就接受空载体（EV，蓝色）、act-1/EV（10% act-1，黄色）、arx-2（红色）、lev-11（绿色）或unc-60（紫色）RNAi处理的野生型N2动物进行了繁殖实验。繁殖实验的结果是测量48小时内从蛋中孵化出的任何存活动物。

为了确定肌动蛋白的生理和功能后果，我们测量了肌动蛋白和ABPs敲低对寿命和健康期的影响。由于肌肉中的肌动蛋白对于肌肉收缩和动物运动是必需的，我们进行了液体鞭打实验来测量衰老过程中的最大运动能力。我们发现，肌动蛋白或ABPs的敲低会导致老年时运动能力的显著下降（图1G），这表明在所有条件下肌肉功能都受到了显著干扰。值得注意的是，肌动蛋白和arx-2的敲低在第一天的鞭打次数有所增加，但随着年龄的增长这种增加逐渐消失。我们注意到，仅凭鞭打次数无法区分运动能力的增加和运动学的变化（例如，运动弧长的减少），因此我们将这些数据解释为在相同实验条件下的整体运动行为的比较结果，而不是运动能力改善的证据。我们还发现，肌动蛋白的干扰导致后代数量显著减少（图1H），这与肌动蛋白功能在生殖细胞形成和整个动物发育过程中都是必需的一致。

重要的是，这些实验是在未交配的雌雄同体动物中进行的，因此我们无法区分精子或卵细胞对这一表型的特异性贡献。最后，RNAi敲低肌动蛋白或任何ABPs都会导致寿命显著缩短（图2A和2B）。由于我们的寿命测定是在L1阶段开始的，发育缺陷可能对观察到的表型有所贡献。为了解决这个问题，我们在成年后的第1天开始对动物进行RNAi处理。在这种情况下，只有arx-2敲低导致了寿命的一致且统计上显著的缩短（图S1F和S1G）。这些数据表明，除了Arp2/3功能异常外，肌动蛋白和ABPs的干扰主要通过影响发育过程来影响寿命。

图2显示，对肌动蛋白调控基因进行全动物RNAi处理会诱导转录组的衰老变化：
全图说明：
(A) 从孵化开始就接受空载体（EV，蓝色）或不同比例act-1:EV RNAi（1:9（黄色）或2:8（黑色）处理的野生型N2动物的寿命。
(B–F) 从孵化开始就接受空载体（EV，蓝色）、arx-2（红色）、lev-11（绿色）或unc-60（紫色）RNAi处理的野生型N2动物的寿命。寿命统计数据见表S1。图C、D、E和F显示了RNAi敲低后基因表达的全基因组变化火山图，其中红色点表示p值≤0.01且log2FC>|2|的显著差异表达基因，蓝色点表示p值≤0.01且log2FC<|2|的显著差异表达基因，绿色点表示p值≥0.01的显著差异表达基因。差异表达基因列表及表达值见表S3。
(G) 使用BiTAge算法预测成年蠕虫在第1天的年龄。*** = p < 0.01，*** = p < 0.001（使用配对t检验计算）。BiTAge输出结果见表S4。
(H) UpSet图显示了所有测试条件下特有的和共有的差异表达基因的数量。

肌动蛋白细胞骨架在多个影响基因表达的过程中起着重要作用，包括染色质重塑和转录。因此，为了确定肌动蛋白功能障碍是否会导致基因表达的全球变化，我们首先使用全动物批量RNA-seq进行了转录组分析。RNA-seq文库的Phred分数>35，且在重复实验中的映射和聚类一致，表明数据质量很高（图S2A–S2D）。arx-2和unc-60的敲低导致了基因表达的显著变化，而actin和lev-11的敲低则变化较小（图2C–2F）。这可能是由于arx-2和unc-60在整个生物体内的普遍表达及其基本需求。相比之下，lev-11主要在肌肉中表达，因此对整体转录组的影响可能较小。由于肌动蛋白敲低是致命的，需要将其剂量控制在较低水平（本研究中使用的敲低比例为10–20%），因此其影响可能更为轻微。与肌动蛋白功能障碍导致早衰一致，我们还观察到使用BiT年龄算法测量的转录组年龄在arx-2和unc-60敲低后加速，而在肌动蛋白或lev-11敲低时则没有这种现象（图2G）。为了确定单个肌动蛋白调控基因的敲低是否会导致其他肌动蛋白调控基因的补偿性上调，我们接下来分析了主要肌动蛋白调控基因的表达变化。令我们惊讶的是，在我们所有的敲低条件下，大多数肌动蛋白调控基因要么下调，要么没有受到影响（图S2E）。

接下来，我们进行了UpSet图分析，以确定肌动蛋白功能障碍是否具有共同的转录组特征。令人惊讶的是，大多数敲低条件下的转录组变化差异很大，只有arx-2和unc-2敲低显示出显著的重叠（图2H）。比较arx-2和unc-60敲低条件下的差异表达基因（DEGs）发现，两组之间的一致性非常高，几乎所有DEGs都是共享的（图S3A和S3B）。尽管arx-2和unc-60也与lev-11有显著的一致性，但这两组之间的基因重叠数量相对较少（<200），而arx-2和unc-60之间的基因重叠数量较多（>1500），这表明这两种基因在所有组织中都普遍表达，可能是必需的，而lev-11主要在肌肉中富集（图S3C、S3D、S3F和S3H）。进一步的基因本体学（GO）分析显示，对肌动蛋白破坏的共同反应是明确的，变化与免疫和防御反应相关（图S4），表明至少有一个基因特征在所有条件下都是共享的。与这一假设一致，GO分析显示arx-2和unc-60之间上调的DEGs主要与免疫反应相关（图S3E）。相比之下，arx-2和unc-60之间下调的DEGs的GO分析显示的变化主要与代谢过程相关（图S3G）。由于lev-11敲降低显示出最独特的基因表达变化，我们对独特的DEGs进行了GO分析，发现一部分基因表达变化与肌肉功能相关（图S3I）。有趣的是，神经肽信号是最丰富的GO术语，尽管这与神经肌肉接头处神经信号在协调适当肌肉收缩中的作用一致。

由于我们观察到细胞骨架破坏后整个动物的健康和寿命发生了变化，接下来我们研究了肌动蛋白破坏对细胞健康和衰老指标的影响。C. elegans中常规研究了几种衰老的生物学标志物，包括线粒体功能障碍、营养失调、菌群失衡、蛋白质稳态和自噬。此外，已证明肌动蛋白细胞骨架参与调节许多这些途径，尽管肌动蛋白与这些细胞机制的直接相关性及其对衰老的影响尚未得到广泛研究。因此，我们直接测量了肌动蛋白功能障碍对许多与年龄相关的细胞过程的影响。在几乎所有生物（包括C. elegans、小鼠和人类）中，线粒体功能在衰老过程中都会退化。肌动蛋白在调节线粒体健康方面起着关键作用，包括线粒体分裂、融合、运动性和线粒体损伤反应。

因此，我们使用矩阵定位的绿色荧光蛋白（MLS::GFP）在肠道、表皮和肌肉中可视化肌动蛋白和ABPs敲低对线粒体形态的影响。肌动蛋白的破坏导致肠道、肌肉和表皮中线粒体形态的显著变化（图3A–3F）。我们的定性线粒体图像显示，肌动蛋白、arx-2和unc-60的敲低导致衰老过程中线粒体碎片化增加，而lev-11敲低则导致线粒体网络更加融合。

为了量化线粒体形态，我们使用了mitoMAPR，该工具可以自动量化线粒体长度、连接点和线粒体数量及线粒体在定义区域内的总面积。尽管mitoMAPR能够以无偏的方式稳健地量化线粒体长度，但在需要图像骨架化的情况下（尤其是当线粒体融合和分裂发生重大变化时）存在一些局限性。因此，我们的定性数据并不总是与mitoMAPR的定量分析结果一致，除非在某些条件下（图3D–3F）。

为了更直接地确定我们在形态学上观察到的变化是否反映了线粒体的可量化功能变化，我们使用先前验证的Seahorse试剂盒测量了整个动物的线粒体呼吸率。与线粒体形态的变化一致，肌动蛋白的破坏导致氧消耗率（OCR）显著下降，表明线粒体形态的变化直接影响了线粒体功能。有趣的是，lev-11敲低对OCR的影响最为显著。然而，由于lev-11敲低即使在第一天也会导致肌肉功能显著缺陷（图1G），因此lev-11敲低也可能破坏非线粒体呼吸，因为这在C. elegans中主要由肌肉功能驱动。实际上，即使使用抑制线粒体呼吸的叠氮化钠处理，lev-11敲低仍然降低了OCR，这表明lev-11敲低同时降低了线粒体和非线粒体呼吸。

鉴于线粒体是脂质合成和β-氧化的中心枢纽，其破坏可能会影响脂质稳态，我们接着假设细胞骨架缺陷可能间接导致脂质失调。因此，我们使用脂滴标记蛋白DHS-3:GFP测量了整个生命周期中肌动蛋白破坏时肠道中的脂滴水平。有趣的是，ABPs arx-2、unc-60和lev-11的敲低都在中期和老年期导致脂滴水平下降。虽然所有条件下的DHS-3:GFP信号都呈现下降趋势，但unc-60和lev-11的信号下降最为显著。然而，由于DHS-3:GFP既存在于脂滴中也存在于细胞质中，我们完成了对DHS-3:GFP标记的高分辨率共聚焦显微镜观察，以研究脂滴数量、大小和形态的具体变化（图4C）。有趣的是，在ABP被敲低的情况下，脂滴的数量没有明显下降，但呈现增加的趋势，只有第1天的动物显示出统计学上的显著性（图4D）。然而，在肌动蛋白功能受损的情况下，脂滴的大小显著减小（图4E）。低倍率成像显示信号减弱，这可能是由于脂滴大小减小所致。总体而言，我们的数据表明肌动蛋白和ABP的敲低会导致脂质稳态的失调，这一结论得到了我们的RNAseq分析的支持，我们在其中发现了许多脂质调节基因的差异表达（图4F）。

图4 肌动蛋白功能受损导致衰老过程中脂滴大小减小
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（A）通过可视化DHS-3:GFP显示的脂滴的代表性荧光立体显微镜图像。动物在孵化后分别培养在空载体（EV）、1:9比例的act-1/EV（10% act-1）、arx-2、lev-11或unc-60 RNAi条件下。所有动物在成年后的第1天、第5天和第9天都进行了成像。
（B）基于每种实验条件下的≥12只动物的3个生物重复样本，通过积分强度量化GFP信号。每个时间点使用双因子ANOVA进行分析。
（C）通过可视化DHS-3::GFP显示的脂滴的代表性荧光共聚焦图像。动物在孵化后分别培养在空载体（EV）、1:9比例的act-1/EV（10% act-1）、arx-2、lev-11或unc-60 RNAi条件下。所有动物在成年后的第1天、第5天和第9天都进行了成像。比例尺为10 μm。
（D）基于每种实验条件下的≥4只动物的3个生物重复样本，量化每只动物中的脂质数量。每个时间点使用双因子ANOVA进行分析。
（E）基于每种实验条件下的≥4只动物的3个生物重复样本，量化每只动物中的平均脂质大小（以像素为单位）。每个时间点使用双因子ANOVA进行分析。
（F）参与脂质稳态的基因表达变化的热图（GO:0055088）。有关热图中使用的基因的表达细节，请参见表S6。

另一个随着年龄增长而下降但对生物体健康至关重要的细胞功能是蛋白质稳态或蛋白质组稳态。具体来说，受损或错误折叠蛋白质的降解对于维持蛋白质组稳态至关重要。最近的研究表明，肌动蛋白在蛋白质组稳态的维持中起着关键作用，特别是通过蛋白酶体的调控。重要的是，肌动蛋白功能的破坏会加剧神经元中蛋白质的聚集，从而导致神经退行性疾病。因此，我们观察了与黄色荧光蛋白融合的人类易聚集蛋白polyQ40在神经元中的表达。在这里，我们使用了pan-neuronal Q40品系，该品系在神经毒性条件下表现出非常明显的表型，神经元中的聚集灶会释放到体腔中。敲低unc-60导致整个衰老过程中聚集灶的数量和大小显著增加（图5A–5C）。有趣的是，尽管lev-11主要在肌肉中表达，但其敲低也导致了神经聚集灶的数量和大小的类似增加（图5A–5C），这表明肌肉健康的受损可能会间接影响神经元，或者存在一个从肌肉到神经元的信号传递轴，从而影响蛋白质稳态途径。这与我们的转录组数据一致，数据显示lev-11敲低导致了多种神经肽相关基因的差异表达（图S3I）。值得注意的是，尽管arx-2敲降没有表现出聚Q水平的持续变化（图5），但由于arx-2敲降动物的寿命显著缩短，可能存在存活率偏差，从而影响了中期和晚期的结果。为了确定存活率偏差是否导致了结果的不一致，我们在更多的衰老时间点测量了聚Q聚集灶的数量。有趣的是，我们发现在成年后的第3天，arx-2敲降动物的聚Q聚集灶数量较低，这表明Arp2/3复合体的扰动可能以不同于其他肌动蛋白干扰方式影响蛋白质组稳态（图5D和5E）。值得注意的是，pan-neuronal Q40品系是一种全身性的RNAi背景，其中神经元对RNAi具有很强的抗性，这表明观察到的蛋白质组稳态效应可能是由于神经元中的轻微敲降和/或非细胞自主效应的共同作用所致。

图5 肌动蛋白功能受损导致蛋白质组稳态失调
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（A–C）在成年后第1天、第5天和第9天，表达神经元多聚谷氨酰胺重复序列（rgef-1p::polyQ40::YFP）的动物中蛋白质聚集的代表性立体显微镜图像。动物在孵化后分别培养在空载体（EV）、1:9比例的act-1/EV（10% act-1）、arx-2、lev-11或unc-60 RNAi条件下。聚集体（B）总数和（C）平均聚集体大小的量化基于每种实验条件下的≥12只动物的3个生物重复样本。每个时间点使用双因子ANOVA进行分析。
（D）在成年后第1天、第3天和第5天，表达神经元多聚谷氨酰胺重复序列（rgef-1p::polyQ40::YFP）的动物中蛋白质聚集的代表性立体显微镜图像。动物在孵化后分别培养在空载体（EV）或arx-2 RNAi条件下。
（E）基于每种实验条件下的≥12只动物的3个生物重复样本，量化聚集灶的总数。统计显著性通过Welch’s t检验确定（GraphPad）。***p < 0.001 和 ***★★p < 0.0001。

蛋白质聚集的主要清除途径之一是自噬。此外，肌动蛋白的动态重塑对自噬过程的多个阶段至关重要，包括自噬体的形成、货物隔离和囊泡运输。肌动蛋白丝不仅提供了膜变形所需的机械力和支架，还协调了自噬机制的空间组织。因此，为了研究肌动蛋白功能障碍对自噬的影响，我们使用了表达GFP标签的LGG-1/Atg8报告基因的C. elegans来观察自噬体。我们发现肌动蛋白功能障碍以组织特异性的方式显著改变了自噬体的数量。在肠道中，肌动蛋白、unc-60和arx-2的敲降都导致LGG-1聚集灶的数量显著增加，而lev-11的敲降则意外地导致LGG-1聚集灶的数量减少（图6A和6B）。有趣的是，在肌肉细胞中，肌动蛋白、unc-60和arx-2的敲降都导致LGG-1聚集灶的数量显著减少，而lev-11的敲降没有显著影响（图6B和6D）。令人惊讶的是，这些敲降条件对皮下缝合细胞的LGG-1聚集灶没有任何影响（图6B和6C）。这些组织特异性和双向的变化表明，肌动蛋白功能障碍并不均匀地增强或抑制自噬体的形成，而是可能根据细胞环境的不同而影响自噬体的启动或周转。由于仅凭自噬体数量的变化无法区分自噬流量的增加和降解能力的下降，我们接下来测量了SQST-1/p62的水平。p62/SQST-1受体蛋白对于泛素化蛋白质聚集体的自噬周转是必需的，并且本身也会被自噬降解。正常情况下，SQST-1:GFP在头部区域的点状结构中表达，但在自噬受损时会在肠道和胚胎组织中积累。RNAi敲降肌动蛋白或任何ABP会导致SQST-1:GFP聚集灶的数量相对于野生型动物有所增加，尽管不如autophagy缺陷的atg-3(b412)突变体那么明显（图6E和6G）。LGG-1/Atg8聚集灶的变化和SQST-1/p62的积累与自噬受损一致，尽管程度较轻。我们在大规模测序数据集中进一步检查了自噬基因的表达变化，发现arx-2和unc-60的敲降导致表达上调，而act-1和lev-11的敲降导致表达下调（图6F）。这些数据表明，类似于肌动蛋白组织的改变，不同肌动蛋白调节成分的RNAi敲降对每种组织中的自噬可能有不同的影响。

图6 肌动蛋白功能障碍导致组织特异性的自噬失调
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（B）对照组和RNai处理的动物（敲低act-1、arx-2、unc-60或lev-11）在肠道、皮下缝合细胞和肌肉细胞中的GFP::LGG-1聚集灶的代表性图像。 violin图显示了（A）肠道细胞（CTRL，N = 63–107；act-1，N = 113；arx-2，N = 63；unc-60，N = 71；lev-11，N = 74细胞），（C）皮下缝合细胞（CTRL，N = 84–87；act-1，N = 87；arx-2，N = 51；unc-60，N = 45；lev-11，N = 70细胞）和（D）肌肉细胞（CTRL，N = 84–88；act-1，N = 88；arx-2，N = 51；unc-60，N = 37；lev-11，N = 57细胞）中GFP::LGG-1聚集灶的量化。数据来自三到五次独立实验。统计显著性通过Welch的双尾t检验确定（GraphPad）。ns: p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。比例尺为10 μm。
（E）在成年后第1天，表达SQST-1:GFP的转基因动物在空载体（ev）、10% act-1、arx-2、lev-11或unc-60 RNAi条件下，以及在ev上培养的ATG8/atg-3(b412)突变体上的代表性立体显微镜图像。
（F）参与自噬的基因表达变化的热图（p < 0.05，直接在AmiGO2中标记为“autophagy”）。有关热图中使用的基因的表达细节，请参见表S6。
（G）基于每种实验条件下的≥12只动物的3个生物重复样本，量化GFP聚集灶的总数。统计显著性通过双因子ANOVA确定（GraphPad）。

最后，跨物种死亡率的一个核心原因和预测因素是肠道屏障功能障碍。在C. elegans中，肠道内膜含有由肌动蛋白介导的紧密连接，这些连接在衰老过程中会分解，导致细菌在肠道中定植。此外，在哺乳动物肠道上皮细胞的体外和体内研究中已经证明，β-细胞质肌动蛋白对于正常的屏障功能是必需的，而在小鼠中特异性删除β-细胞质肌动蛋白会导致肠道通透性增加并加剧实验性结肠炎。我们之前的工作已经证明，通过bet-1过表达稳定肌动蛋白纤维可以保护C. elegans免受老年期的细菌定植。此外，我们的大规模RNA-seq显示，在所有敲降条件下，与免疫相关的基因都有广泛的转录组响应（图S4）。因此，我们首先测量了肌动蛋白的直接扰动是否会影响肠道屏障的完整性。利用成熟的荧光细菌定植测定方法，我们发现RNAi敲降肌动蛋白或ABPs在任何年龄都没有显著改变肠道定植（图S5A和S5B）。为了更直接地测量肠道屏障的完整性，我们接下来观察了肠道屏障蛋白DLG-1:GFP的定位。在C. elegans中，DLG-1同源物1（DLG-1）定位于与肌动蛋白结合的粘附连接处，肌动蛋白将这些连接蛋白锚定在肠道上，从而维持屏障的完整性，其定位可以作为一种定量的屏障完整性测量方法。我们观察到DLG-1定位随年龄增长而变化，在较老的动物中这种变化更加明显。值得注意的是，肌动蛋白或ABPs的敲降进一步加剧了这种错位（图S5C）。

肌动蛋白功能障碍的细胞类型特异性影响
我们发现RNAi敲降ABPs在每种测试的组织中产生了不同的效果（图1），这引发了这样一个有趣的假设：每种细胞类型对肌动蛋白调节蛋白有不同的需求。考虑到每种组织中肌动蛋白的结构和功能差异巨大，这一点并不令人惊讶。为了进一步测试肌动蛋白和ABPs的细胞类型特异性需求，我们使用了细胞类型特异性的RNAi品系。这些品系使用了rde-1基因的突变，该基因编码处理RNAi所需的Argonaute机制，随后进行细胞类型特异性的rde-1恢复。为了实现神经元特异性，我们使用了sid-1基因突变的C. elegans品系，sid-1基因编码RNAi功能所需的双链RNA导入蛋白，随后进行神经元特异性的sid-1恢复。虽然全动物RNAi敲降肌动蛋白是致命的，因此需要将RNAi稀释到10%，但细胞类型特异性的肌动蛋白敲降并不致命（图S6），因此我们对10%和100%的肌动蛋白RNAi进行了细胞类型特异性研究。正如预期的那样，actin和ABP的表达抑制在每种特定细胞类型中产生了不同的效应（图7）。图7显示了actin破坏对寿命的组织特异性影响。图7中的寿命数据表明，仅在（A）表皮层、（B）肠道、（C）肌肉和（D）神经元中使用功能性RNAi的动物的寿命情况。这些动物分别使用的是空载体（EV，蓝色）、100% act-1（黑色）、10% act-1（黄色）、arx-2（红色）、lev-11（绿色）或unc-60（紫色）RNAi进行培养。图（E）显示了在L1阶段使用组织特异性功能性RNAi培养后，与对照组相比，动物平均寿命的变化百分比（% MLS变化）。顶部的水平值代表每种条件下中位寿命的平均百分比变化。误差条表示标准差，* = p < 0.05，*** = p < 0.01，这是通过双边单样本t检验与假设均值0进行比较得出的结果。例如，lev-11的表达抑制在肌肉中的寿命缩短效应最为显著，而在肠道中的影响相对较轻，在表皮层和神经元中没有影响（图7）。这与lev-11是一个主要存在于肌肉中的基因相符，其表达抑制对肌肉中的actin形态变化影响最大（图1E和1F）。unc-60的表达抑制在肠道中的寿命缩短效应最为显著，这也与我们的成像数据一致，数据显示unc-60的表达抑制在成年早期第1天就导致肠道中actin的紊乱（图1A和1B）。unc-60的表达抑制在肌肉和神经元中也表现出轻微的寿命减少，但在表皮层中几乎没有影响。最后，arx-2的表达抑制是唯一一种在所有组织中都一致缩短寿命的基因。

为了更好地理解ABP表达抑制对健康和寿命影响的潜在遗传机制，我们使用先前验证的协议进行了系统性的ABP表达抑制的单核RNA测序（snRNA-seq）研究，并对其大量RNA-seq数据集进行了反卷积处理。在我们的研究中，除了unc-60（图S7A）外，大多数情况下我们能够收集到动物最大组织的数千个细胞核的snRNA序列数据。unc-60条件下细胞核数量较少可能是由于cofilin对细胞核结构或细胞分裂的影响。此外，我们还从生殖缺陷突变体中收集了snRNA-seq数据，以减少生殖系统的过度代表并提高体细胞类型的解析度。因此，由于野生型动物中生殖系细胞核占主导地位，每个动物恢复的细胞核总数有所减少。重要的是，我们的细胞核数据显示每种条件下的细胞聚类都非常明显（图S7B–S7E）。每种条件下，我们每个样本大约测序了2,000到8,000个细胞核（图S7A）。细胞核是从多个批次收集的动物群体中分离出来的；因此，该数据集反映了多个生物个体的平均转录状态，而不是单个个体的情况，从而减少了个体水平的随机变异。这种汇总设计与使用相同协议的已发表的秀丽隐杆线虫snRNA-seq研究结果一致。

尽管之前的研究显示，由于在单次测序过程中涉及数百只动物，秀丽隐杆线虫snRNA-seq数据集的技术变异相对较小，但为了确保我们的数据不会因为仅进行了一次重复实验而产生偏差，我们使用了包含多个生物学重复次的snRNA-seq数据集来进行大量RNA-seq数据的反卷积处理，而不是直接分析snRNA-seq数据集本身。首先，我们对比了不同组织和目标中的转录反应，以获得系统性的ABP表达抑制的组织特异性效应的整体视图。Spearman相关性分析揭示了一些意外的相似性和差异。值得注意的是，肌肉中的lev-11和arx-2表达抑制以及表皮层中的unc-60和arx-2表达抑制显示出高度相似性，这表明这些组织可能在维持细胞骨架完整性或应对actin功能障碍方面具有共同的机制。相比之下，lev-11表达抑制在肠道中的转录谱与其他组织明显不同（图S8A）。有趣的是，我们发现肠道在每种条件下的转录特征最为显著，可能是因为肠道对RNAi更敏感和/或对actin破坏反应更强烈（图S8B）。作为探索性研究，我们调查了与长寿相关的基因表达变化程度，包括线粒体组织、脂质调节、免疫反应、蛋白质翻译、自噬和一般的actin相关基因表达。正如预期的那样，在ABP表达抑制的情况下，许多与线粒体组织相关的基因在表皮层、肠道和肌肉中下调（图S8C），这与这些条件下线粒体碎片化和功能丧失是一致的。有趣的是，表皮层在ABP表达抑制下上调和下调的基因数量相似，而神经元主要表现为基因上调。我们只在ABP表达抑制下观察到少数与actin功能相关的基因上调（图S8D），这表明actin的破坏并不会激活actin相关基因的普遍上调反应。同样，不同组织中脂质相关基因的变化也很轻微（图S8E）。我们发现参与免疫反应的基因在所有组织中的表达都存在差异，其中肠道的变化最大，肌肉的变化最小（图S9A）。考虑到免疫反应基因的变化是我们所有数据集中几乎所有条件共有的反应之一，并且所有actin和ABP表达抑制条件都会影响肠道屏障的完整性，这一点并不令人惊讶。据报道，暴露于压力的秀丽隐杆线虫可以下调翻译活动；然而，我们在肠道或其他任何细胞类型中都没有发现蛋白质翻译相关基因的重大变化（图S9B）。我们还在不同组织中观察到了自噬相关基因表达的相似变化（图S9C）。由于肠道在ABP表达抑制下具有最多的差异表达基因（DEGs），接下来我们进行了GO分析，以进一步研究在肠道中特异性改变的具体途径。我们发现arx-2表达抑制导致免疫反应特征更为显著，而unc-60表达抑制则引发了免疫反应和代谢相关的基因表达变化（图S9D和S9E）。另一方面，lev-11表达抑制导致的变化与代谢或免疫反应均无关（图S9F）。在这里，我们有意避免过度分析基因表达的变化，因为这些数据是基于使用单个snRNA-seq数据集对大量RNA-seq数据进行反卷积得到的，仅作为未来机制研究的探索性资源。

然而，为了确定我们的反卷积数据是否因为使用了单一重复的snRNA-seq数据集而存在潜在的技术偏差，我们使用已发表的野生型snRNA-seq数据集独立地对大量RNA-seq数据进行了反卷积处理（图S10）。当使用野生型参考数据进行反卷积时，数据明显偏向于野生型表达特征：样本在每种细胞类型内聚类得更紧密，区分actin表达抑制条件的分辨力大大降低（图S10A）。尽管如此，仍然保留了一些稳健且不变的特征。值得注意的是，两种反卷积方法在arx-2和unc-60表达抑制后都显示出了相似的免疫反应特征（图S9D、S9E和S11）。综上所述，虽然大量RNA-seq数据的反卷积可以提供有用的信息，但应考虑数据可能偏向于参考snRNA-seq数据集的可能性，并且在解释数据和得出结论时需要谨慎。因此，结合多种方法进行分析更有可能产生稳健的结果，实验验证至关重要。因此，我们提供了我们的数据集作为假设生成的有用资源，并有意避免过度分析我们的数据或得出广泛的结论。

使用小分子抑制剂靶向actin细胞骨架会影响衰老过程。遗传学方法是机制研究的优秀方法，但在转化研究中尤其是对人类来说更为有限。作为一种替代方案，小分子抑制剂，特别是那些来自天然来源的抑制剂，在递送和下游效应方面具有优势。海洋天然产物已成为研究细胞骨架、神经科学和线粒体动力学的下一代化学探针的丰富来源。为了补充我们的遗传学工具，接下来我们使用了actin细胞骨架的小分子调节剂。LatA可以结合G-actin并促进其解聚，而Jasp可以稳定F-actin并增强其聚合。LatA和Jasp分别从C. mycofijiensis和J. splendens的二氯甲烷提取物中纯化，并通过1H NMR与文献值进行了化学验证（图S12）。正如预期的那样，使用LatA破坏actin会导致寿命的剂量依赖性减少（图8A），这与我们使用RNAi表达抑制的研究结果一致。相比之下，Jasp在低浓度下延长了寿命，但在高浓度下则缩短了寿命（图8B），这表明在一定程度上增加actin的稳定性是有益的，超过某个临界点后可能会产生毒性效应。为了验证这些化合物处理确实以预期的方式改变了F-actin的稳定性，我们使用LifeAct:mRuby对F-actin进行了可视化观察。正如预期的那样，LatA显著减少了表皮层和肌肉中的可见F-actin结构（图8C和8D；图S13）。有趣的是，Jasp增加了通常不存在于表皮层中的F-actin结构，类似于之前报道的通过过表达转录调节因子bet-1增加actin稳定性时观察到的结构（图8E和8F）。同样，Jasp在低剂量下增加了肌肉中的actin纤维稳定性（S13A,C）。总之，我们的数据表明，小分子actin抑制剂可以用于体内衰老实验，并且能够反映遗传学方法发现的表型。

图8显示了使用小分子操纵actin如何改变寿命和线粒体网络。图8中的（A）展示了从成年第1天开始，在空载体（EV）和不同浓度的Latrunculin A（1 μM（紫色）、2.5 μM（粉色）、5 μM（绿色）、10 μM（浅紫色）、0 μM（对照，黑色）培养的野生型N2动物的寿命。（B）展示了在空载体（EV）和不同浓度的Jasplakinolide（1 μM（紫色）、2.5 μM（粉色）、5 μM（绿色）和0 μM（对照，黑色）培养的野生型N2动物的寿命。寿命统计数据见表S1。（C）展示了在空载体（EV）和不同浓度的Latrunculin A（1 μM、2.5 μM、5 μM）或DMSO对照培养的、表达LifeAct:mRuby的成年动物在表皮层中的代表性荧光图像。（D）展示了在空载体（EV）和不同浓度的Latrunculin A（1 μM、2.5 μM、5 μM）或DMSO对照培养的、表达LifeAct:mRuby的动物在表皮层中的actin结构定量。N = 3，n > 5。（E）展示了在空载体（EV）和不同浓度的Jasplakinolide（1 μM、2.5 μM、5 μM）或DMSO对照培养的、表达LifeAct:mRuby的成年动物在表皮层中的代表性荧光图像。所有动物均在成年第4天和第8天进行成像，成像设备为Leica Thunder Imager。（F）展示了在空载体（EV）和不同浓度的Jasplakinolide（1 μM、2.5 μM、5 μM）或DMSO对照培养的、表达LifeAct:mRuby的动物在表皮层中的actin结构定量。N = 3，n > 5。（G）展示了从成年第1天开始，在空载体（EV）和1 μM Latrunculin A及1 μM Jasplakinolide条件下培养的、表达col-19p::MLS::GFP的动物，同时进行了DMSO对照，在成年第5天、第9天和第13天进行了成像。（H）使用mitoMAPR进行了定量分析。“对象/线粒体足迹”指的是检测到的线粒体总数以及定义感兴趣区域内所有线粒体所占的面积。所有图像的比例尺为10 μm。

为了进一步评估LatA和Jasp对actin对下游细胞过程的影响，我们测量了用1 μM LatA和Jasp处理的动物中的线粒体形态，因为它们在寿命方面产生了相反的结果。这里我们使用了表皮层线粒体菌株，因为它在随年龄增长时线粒体形态的变化最为显著。正如预期的那样，LatA处理导致线粒体碎片化的程度增加，但使用mitoMAPR量化时这种差异没有达到统计学显著性（图8G和8H）。有趣的是，尽管Jasp处理延长了寿命，但在晚年却导致了线粒体的碎片化增加。然而，考虑到肌动蛋白在线粒体融合和分裂中的关键作用，改变肌动蛋白的动态可能会影响线粒体的形态。最后，我们对从成年第一天开始接受1 μM LatA和1 μM Jasp处理的动物在用药24小时（第二天）和120小时（第六天）后进行了批量RNA测序。RNA-seq文库显示Phred分数>35，且在重复实验中映射和聚类结果一致，表明数据质量很高（图S14）。我们发现LatA在用药24小时后引起了转录组的明显变化，到成年第六天这种变化更为显著（图S15A–S15D）。重要的是，几乎所有LatA处理动物的差异表达基因（DEGs）与arx-2和unc-60敲低实验中的差异表达基因重合（图S15F–S15K），这进一步证明了我们的化学和遗传方法具有相似的效果。然而，与ABP敲低相比，化学处理的差异表达基因数量显著较少。实际上，我们发现Jasp对转录组的影响非常轻微，在成年第一天没有差异表达基因，而在第六天只有6个差异表达基因（图S15C和S15D）。Jasp和LatA处理均未显著改变肌动蛋白调节基因的表达，除了act-5的表达显著增加（图S15E）。需要注意的是，RNAi实验在L1阶段开始，而药物处理则是在成年后开始；因此，这些数据集不能直接进行定量比较，比较仅限于通路水平的一致性。

接下来，我们使用BiT年龄算法评估了转录组的年龄。在成年第二天，Jasp和Latrunculin处理并没有显著改变相对于DMSO对照组的转录组年龄。有趣的是，在第六天，Jasp和Latrunculin处理的转录组年龄都比对照组更老（图S14E）。为了进一步确定肌动蛋白的遗传或化学修饰是否反映了与衰老相关的变化，我们将整个批量RNA-seq数据集与金标准衰老模型daf-2（胰岛素/IGF1）进行了比较。重要的是，正如预期的那样，daf-2突变动物的转录组年龄更年轻（图S16A）。此外，我们没有发现我们的RNAi敲低或LatA数据集与daf-2突变体之间存在显著的一致性（图S16B–S16I），因为这些条件下的动物寿命较短，而daf-2突变体寿命较长。同样，长期接受Jasp处理的动物也与daf-2动物之间没有一致性（图S16J和S16K）。总之，这些数据表明LatA和Jasp的影响部分但并非全部类似于肌动蛋白遗传扰动的效果。此外，LatA和Jasp可能独立于对转录组的影响，同时影响肌动蛋白和寿命。

基于肌动蛋白在真核生物中的高度保守性及其功能的中心性，我们认为肌动蛋白也可能影响人类的衰老表型。在这里，我们关注了ACTB基因位点内的自然发生的单核苷酸多态性（SNPs）的遗传变异，并测量了它们与与人类衰老相关的表型的潜在关联，特别关注与肌肉衰老相关的表型。我们分析了健康与退休研究（HRS）中的全基因组关联研究（GWAS）数据；这是一个针对美国超过36,000名50岁以上成年人的全国代表性纵向研究。HRS包含部分参与者的生物和遗传样本，并包括所有老年参与者的身体和心理社会测量数据，包括多种与肌肉功能相关的指标。SNPs rs852540和rs73047183在与HRS非西班牙裔白人样本中显示出与步速随时间减缓的速度下降有显著的关联（图9A）。具体来说，每个额外的rs852540 G等位基因使得步速每年平均下降0.035米/秒（图9B），p值=0.0329，超过了0.05的宽松提示阈值。这项研究在N=3684名平均基线年龄为66.33岁（标准差=8.26岁）的老年人中进行，他们的步速平均每年下降0.002米/秒（标准差=0.0005）。我们还确认HRS队列表现出预期的与年龄相关的步速下降（图9C）。

全基因组关联研究揭示了肌动蛋白与人类衰老结果之间的联系。有趣的是，我们并未观察到这些通路中候选保守调控因子的协调变化，包括unc-120、yap-1、wts-1、mob-1或fos-1，这表明在胰岛素细胞骨架长期受损的情况下，这些经典 Mechanical Transduction 通路并不会被主要激活。相反，胰岛素细胞骨架的破坏引发了一个更广泛的应激反应转录程序，其特征是诱导了先天免疫和应激响应基因的表达。这些发现表明，与胰岛素功能障碍相关的衰老表型更可能是通过整合的应激适应通路来介导的，而不是通过经典的SRF/YAP样转录响应。为了进一步探索组织特异性的转录反应，我们将我们的批量RNA-seq数据集与snRNA-seq参考数据进行了去卷积处理。虽然不同参考数据对组织特异性效应的解析能力有所不同，但在多种分析策略中都复现了一些普遍的模式，例如在arx-2和unc-60敲低后出现了明显的肠道免疫相关特征。其他与长寿密切相关的通路则表现出组织特异性的、相对较小的变化。鉴于去卷积结果对参考数据选择的敏感性以及数据可能偏向这些参考数据的问题，这些发现应被视为假设生成的，而不是机制性的。总的来说，转录组和去卷积分析通过概述细胞骨架破坏后组织依赖性和情境依赖性的反应，补充了表型数据。这些数据集并非建立了胰岛素功能障碍与转录衰老之间的直接因果关系，而是为未来旨在将胰岛素功能障碍与衰老病理学联系起来的研究提供了资源。例如，我们已经将胰岛素功能障碍与几种被认定为衰老生物学标志的细胞生物学表型联系起来。

线粒体功能障碍是跨物种中最明确的衰老特征之一，也许也是与衰老相关的胰岛素作用中最被广泛研究的一个方面。例如，在酿酒酵母中，胰岛素对于有丝分裂过程中线粒体的不对称传递是必需的，这样就可以产生一个具有完整复制寿命的完整子细胞。此外，在衰老的果蝇大脑中，胰岛素的聚合增加会导致F-actin的过度积累，从而损害自噬作用并增加线粒体功能障碍，缩短寿命。尽管在哺乳动物系统中尚未揭示胰岛素-线粒体相互作用对长寿的直接影响，但考虑到胰岛素在线粒体动态中的重要作用以及线粒体融合/分裂动态失调与多种衰老病理指标的直接相关性，不难推测与年龄相关的胰岛素失调可能通过其对线粒体动态的影响直接作用于细胞和生物体的健康。事实上，我们发现定向的胰岛素功能障碍会导致线粒体结构和功能的重大变化。重要的是，无论是在增加还是减少胰岛素稳定性的方向上使用小分子进行干预，都会导致线粒体碎片化的增加，这对于针对线粒体动态的胰岛素干预是一个关键考虑因素。由于许多线粒体融合和分裂因子是共享的，包括胰岛素细胞骨架，因此很难预测胰岛素的变化如何影响线粒体。例如，我们的数据显示，胰岛素、arx-2或unc-60的基因敲低会导致线粒体碎片化，而lev-11的敲低则会增加线粒体融合。由于原肌球蛋白可以与胰岛素结合，从而影响其稳定性，同时肌球蛋白马达也可以与胰岛素结合影响收缩性，因此原肌球蛋白的破坏可能会影响依赖于这两种过程的线粒体融合和分裂机制。通常情况下，线粒体融合和分裂的破坏会保持相对管状的网络结构。因此，原肌球蛋白的敲低可能会通过不同程度地损害这两种过程，使线粒体网络向过度融合的状态转变。

除了线粒体功能外，胰岛素细胞骨架和线粒体之间还共享一些应激响应转录因子。例如，热休克转录因子HSF-1已被证明对于维持胰岛素稳定性以及调节UPRMPT至关重要。在我们的数据中，我们发现胰岛素和ABPs的敲低也会直接影响线粒体应激响应基因的表达。最后，整合素信号的增强会导致胰岛素稳定性的增加、线粒体的重塑以及线粒体应激反应的激活，这可能直接影响秀丽隐杆线虫的寿命，并可能影响哺乳动物模型中的癌症侵袭性。总体而言，我们的数据增加了越来越多的间接证据，表明胰岛素-线粒体轴与衰老病理学直接相关。脂质稳态也受到影响，胰岛素和ABPs敲低的动物显示出数量显著减少的小脂滴。尽管脂质失调常常与线粒体功能障碍同时发生，但由于线粒体中β氧化的受损，脂质含量通常会增加。因此，在胰岛素功能障碍的动物中，线粒体功能障碍可能会导致脂质代谢途径的增加，以提供能量所需的脂肪酸。事实上，我们发现这些动物的脂质代谢基因显著上调。此外，脂质可以通过自噬途径被清除和代谢，实际上，arx-2和unc-60敲低的动物在肠道中的自噬体数量有所增加。这也与肠道中polyQ的减少一致，表明这种组织中可能发生了增强的蛋白质稳态清除。然而，这种解释受到我们自噬测量的复杂性影响，因为LGG-1点数增加以及SQST-1的积累表明自噬功能受损而不是增强。未来需要使用已建立的自噬通量测定方法（如bafilomycin A1抑制溶酶体）来区分自噬体生成和清除的缺陷。尽管如此，polyQ聚集物的减少可能反映了替代或补偿性降解途径，或者是更复杂的蛋白质稳态变化，而不仅仅是由自噬活性增加所解释的。

值得注意的是，自噬的变化并非在所有胰岛素功能障碍情况或所有组织中都是普遍存在的。有趣的是，lev-11敲低在肠道中减少了自噬体数量，而在肌肉中增加了自噬体数量。考虑到lev-11编码的主要在肌肉中表达的原肌球蛋白，值得注意的是，lev-11敲低也会影响非肌肉细胞中的自噬，这表明其影响可能不是完全细胞自主的。一种可能的解释是，肌肉胰岛素动态的扰动会产生非细胞自主信号，影响其他组织，尽管这还有待直接验证。例如，肌肉特异性过表达TFEB（一种主要调节自噬的转录因子）可以通过肌肉衍生的趋化因子改善大脑功能，这些趋化因子通常被称为“肌凝蛋白”。最后，肌肉特异性激活转录因子FOXO可以全身激活蛋白质稳态途径并延长寿命。因此，lev-11敲导引起的肌肉功能障碍可能会通过细胞间通讯间接影响远端组织的自噬。然而，肌肉缺陷如何影响其他组织的机制尚不清楚。一种可能性是受损的肌肉细胞试图通过向其他组织传递损伤来恢复稳态。例如，肌肉细胞可以将聚集的朊病毒蛋白分泌到邻近的肌肉组织，甚至皮下组织，这一过程依赖于自噬机制。lev-11敲低是否也会导致类似现象仍有待确定。另外，lev-11可能在非肌肉组织中具有低水平或条件依赖性的表达，因此其敲低会直接影响细胞功能。

药理学实验证实，胰岛素动态必须精细调节才能实现健康的衰老。使用LatA降低胰岛素稳定性会导致预期中的寿命缩短，而Jasp在低剂量下可以延长寿命，但在高浓度下则会产生不利影响。这可能是由于轻微稳定胰岛素纤维的有益效果；然而，过度稳定胰岛素可能会因为抑制胰岛素的动态和流动性功能而变得有毒。这让人想起了通过bet-1过表达增加胰岛素稳定性的情况。在特定组织（如肌肉和肠道）中，增加胰岛素稳定性对其功能有利，而bet-1过表达可以延长寿命。然而，在皮下组织中，动态胰岛素对于内吞作用、外排作用和信号传导事件可能是必需的，bet-1过表达会导致胰岛素纤维的异位表达，从而缩短寿命。有趣的是，LatA和Jasp都会增加线粒体碎片化，突显了胰岛素动态对线粒体的复杂调节。这些数据还强调，当胰岛素重塑受到干扰时，仅改变线粒体形态并不能预测对寿命的功能影响。与此一致的是，尽管lev-11敲低也缩短了寿命，但它导致了线粒体网络的过度融合。药物治疗后缺乏大规模的转录组变化表明，在这些条件下，胰岛素主要通过结构和转录后机制影响衰老，而不是广泛的转录重编程。重要的是，LatA和Jasp是从成年期的第一天开始给动物使用的，因为在幼虫阶段使用这些物质会导致发育致死。相比之下，RNAi是从孵化开始应用的。因此，胰岛素的细胞和生理变化可能受到胰岛素功能障碍下游的非转录性和转录性变化的双重影响。如果在发育期间应用胰岛素功能障碍，可能会导致染色质重塑的重大变化——而胰岛素越来越被认为是调节这种变化的因素——从而在整个生命周期中驱动重大的转录变化。相反，如果在发育后应用胰岛素功能障碍，其对转录组的影响较小，因此更多地直接作用于胰岛素的结构和组织。这类似于其他应激范式，如线粒体适应性反应，已被证明需要在幼虫阶段应用，以在整个生命周期中引发显著的染色质重塑。

胰岛素在细胞过程中的作用在进化上是高度保守的，特别是考虑到所有真核生物中胰岛素的序列和结构相似性。考虑到胰岛素在众多细胞和生理过程中的共同作用，我们预测胰岛素在衰老中的潜在作用同样具有保守性。在这里，我们发现ACTB中的常见多态性与两个独立衰老队列中步态速度下降的差异有关，这表明胰岛素调节的自然变异有助于老年人的功能轨迹。尽管效应大小较小，但在不同队列中的重复实验加强了胰岛素变化可以影响人类神经肌肉衰老的结论。在本研究的局限性方面，我们有意以数据为导向呈现发现，避免过度解释数据。我们没有强行得出单一的结论或结论，而是将数据置于更广泛的文献背景下进行解读，从而为未来的研究者提供一个资源，以便他们可以挖掘、整合和发展这些发现。虽然我们的研究表明胰岛素结构和功能在衰老过程中起着关键作用，但未来的研究需要注意几个限制。首先，我们发现的GWAS关联本质上是相关的，且鉴定出的SNP位于非编码区域。因此，测试这些SNP驱动衰老病理的因果关系或分子机制具有挑战性，因为这些非编码区域在如秀丽隐杆线虫这样的模式生物中并不共享。另一个限制是我们分析的人类队列主要具有欧洲血统，这引发了关于我们发现普适性的疑问以及其他人群之间可能存在的差异。在我们的秀丽隐杆线虫研究中，RNAi是从L1发育阶段开始应用的，这意味着发育过程中的扰动可能对成年表型有所贡献。此外，RNAi方法本身也有一些局限性：首先，不同组织之间的RNAi敲低效率各不相同。特别是在某些组织（如咽部或神经元）中，已知RNAi难以发挥作用。这一问题因细胞类型特异性RNAi所需的复杂遗传学要求而进一步加剧，这种RNAi需要基因突变和组织特异性的RNAi机制的恢复。由于这些RNAi机制在基因表达和病原体防御中具有重要的经典作用，因此在天然不高水平表达这些基因的细胞类型中，敲除和随后的过表达可能会产生生理后果。更复杂的是，许多编码ABPs的基因具有多个异构体或基因变异，这些基因可能发挥冗余作用，不同细胞类型表达这些基因的水平各不相同。然而，第一天转录组的显著重塑表明，发育过程中的变化可能会在成年期持续产生影响。此外，我们确认arx-2、lev-11和unc-60的敲低确实以预期的方式扰乱了胰岛素组织，这增强了我们对冗余基因没有补偿其缺失的信心。最终，我们针对成体的特定化学方法成功地复制了RNAi的许多表型结果，这表明肌动蛋白功能障碍对生物体健康和寿命的影响并非都通过发育效应实现，而我们的RNAi实验条件揭示了肌动蛋白直接受扰动后的结果。然而，未来工作中更精确的控制操作将有助于区分发育效应和成体特有的效应，并更好地理解在生命过程中何时应用肌动蛋白干预措施才能对生理和寿命产生影响。我们的snRNA-seq数据集是通过对每种条件进行单次文库制备获得的，这限制了单细胞水平的统计推断，并排除了以发现为导向的单细胞分析。因此，我们仅使用snRNA-seq数据作为组织水平的参考，来对复制的批量RNA-seq数据集进行反卷积处理。为了验证我们的发现是否具有稳健性，我们独立地使用了已发表的三份野生型N2 snRNA-seq数据集作为替代参考进行反卷积；虽然这样做使谱型偏向基线表达状态并降低了条件间的分辨率，但关键的组织水平趋势，特别是肠道免疫反应特征，在两种参考数据中都得到了保留。因此，所有基于snRNA-seq的发现都应被视为假设生成的、组织层面的结果，而不是确定的细胞类型特异性结论。此外，unc-60敲低条件下细胞核回收率显著降低，这可能是由于cofilin在维持细胞核完整性方面的作用，进一步限制了对这一特定条件的解释，因此应对unc-60的反卷积结果格外谨慎。

另一个需要考虑的因素是我们使用了LifeAct:mRuby来可视化活体动物中的F-actin。尽管LifeAct被广泛使用并在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中得到了验证，但其过表达可能会与内源性ABPs竞争蛋白质结合位点，从而可能独立于实验条件扰乱肌动蛋白动态。这意味着我们观察到的一些基础肌动蛋白表型，特别是在年轻动物中，可能受到LifeAct表达本身的影响。我们通过跨基因型和年龄进行比较，并使用表达水平一致的稳定回交转基因系，尽量减少这一担忧。尽管如此，未来使用正交可视化方法的研究对于验证这些结构发现至关重要。

使用秀丽隐杆线虫作为模型系统的一个局限性在于，它们在成年后处于有丝分裂后期，这意味着我们的发现可能无法完全捕捉到肌动蛋白功能障碍对高度增生组织（如哺乳动物的肝脏或皮肤）的影响。这是一个重要的考虑因素，因为肌动蛋白的一个关键作用是在细胞分裂过程中。因此，进一步在具有整个成年生命周期的动物模型中进行研究对于将我们的发现转化为实际应用至关重要。

最后，我们的工作主要关注肌动蛋白的终点测量，即丝状结构、组织和功能如何影响细胞和生物体的生理。然而，肌动蛋白是一个复杂的多蛋白结构，由数百到数千个肌动蛋白亚基与数十到数百个ABPs相互作用共同构成。因此，未来的工作需要探讨肌动蛋白或ABPs的翻译、折叠、翻译后修饰以及这些蛋白质之间的相互作用如何定义肌动蛋白丝状组装、组织和功能的终点测量。这些注意事项既突显了将肌动蛋白定义为生物体健康和寿命关键因素的挑战，也展示了相关机遇。尽管如此，遗传学、药理学和人类全基因组关联研究（GWAS）数据的融合表明，维持肌动蛋白的完整性对于保持衰老组织的细胞健康至关重要，而保持肌动蛋白稳态可能是一种有效的策略来延长生物体的寿命。然而，这些结果主要是描述性和关联性的。要确定自然老化过程中肌动蛋白的变化是衰老的驱动因素、中介因素还是放大因素，需要进行时间控制和组织特异性的挽救实验、下游途径的机制分析，以及在更多动物模型和人体组织中的补充研究。我们全面的数据为未来的研究提供了资源支持。

资源获取
如需资源和试剂，请联系首席联系人Ryo Sanabria博士（[e-mail]）。

材料获取
本研究未生成新的独特试剂。

数据和代码获取
• 数据：评估本文结论所需的所有数据均包含在本文及补充信息中。所有原始RNA-seq数据集可通过Annotare 2.0 Array Express访问，访问号为E-MTAB-16193和E-MTAB-16195。本文分析了现有的、公开可用的GWAS表型和基因型数据，这些数据可在欧洲基因组-表型档案（EGA）中找到，访问号为EGAS00001001036，以及在基因型和表型数据库（dbGaP）中找到，访问号为phs000428.v2.p2。
• 代码：用于分析本研究中数据集的所有代码均可在Sanabria实验室的GitHub仓库中找到：https://github.com/SanabriaLab/Averbukh-et-al.-2026

致谢
M.A.和A.J.C.获得NIA的T32AG052374资助；T.W.获得COMPASS CIRM项目的资助；C.M.L.获得加利福尼亚再生医学研究所的博士前奖学金资助；M.V.、M.O.和T.C.T.获得NIA的1R25AG076400资助；J.K.获得南加州大学校长奖学金资助；E.M.C.获得P30AG068345资助；S.O.获得NIGMS的R01GM144563资助；S.P.C.获得NIH R01AG058610资助和Hevolution基金会的748 HF AGE-004资助；B.A.B.获得NIGMS的GM142395资助；T.A.J.获得DUC的Fletcher Jones Endowment基金资助；M.C.W.获得霍华德·休斯医学研究所的资助；T.E.A.获得P30AG068345资助；C.K.获得NIA的R01AG083373资助；G.G.获得NIA的T32AG052374和R01AG079806-02S1资助；R.H.S.获得NIA的R00AG065200和R01AG079806资助、Glenn医学研究基金会的奖项以及Larry L. Hillblom基金会的2022-A-010-SUP资助。部分菌株由CGC提供，该机构由NIH研究基础设施计划（P40 OD010440）资助。GWAS分析在南加州大学的老年生物学信息学核心实验室进行，并得到了南加州大学和Buck Institute Nathan Shock Center（P30AG068345）的支持。单核RNA测序工作得到了HHMI Janelia研究园区访问科学家计划的协助。秀丽隐杆线虫的实时耗氧率（OCR）使用Seahorse Bioscience的XF96 Analyzer在USC Leonard Davis老年学学校Seahorse核心实验室测量。我们感谢UC Berkeley的Hasan Celik博士和Pines磁共振中心的Core NMR Facility（PMRC Core）提供的仪器支持，这些设备部分得到了PMRC Core和NIH S10OD024998的资助。健康与退休研究（HRS）由美国国家老龄化研究所（NIA U01AG009740）资助，并由密歇根大学实施。ELSA（英国老龄化纵向研究）由美国国家老龄化研究所（grants 2RO1AG7644-01A1和2RO1AG017644）及英国政府各部门组成的联盟资助，协调工作由国家统计局负责。英国老龄化纵向研究的基因分型数据由经济和社会研究委员会（ESRC）及美国国家老龄化研究所提供资助。本文内容仅代表作者观点，不一定代表美国国立卫生研究院的官方立场。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、出版决定或手稿准备。

作者贡献
M.A.设计并执行了所有秀丽隐杆线虫实验，并准备了手稿和图表。H.T.N.、J.K.、S.M.G.、M.C.W.和G.G.协助进行了转录组分析。T.W.、A.A.、T.N.、D.S.、M.V.、N.D.、R.A.B.、A.J.C.、D.M.、T.C.T.、M.O.、M.P.和S.P.C.协助进行了秀丽隐杆线虫的寿命和成像实验。C.M.和C.K.协助进行了自噬实验。K.E.Y.和C.M.H.完成了所有qPCR实验和分析。J.A.G.、S.F.O.、J.G.C.、N.S.、M.S.N.、J.C.P.、H.L-T.和T.A.J.纯化了LatA和Jasp。H.H.M.进行了Seahorse测定。M.A.T.协助了生化实验。B.A.B.协助了snRNA-seq分析和反卷积。S.O.提供了cofilin抗体。E.M.C.和T.E.A.完成了所有GWAS分析。G.G.和R.H.S.协助准备了手稿和图表，并设计、执行和分析了所有实验和数据。

利益声明
本文的所有作者声明没有利益冲突。

在撰写过程中，作者使用了OpenAI的GPT模型来辅助文本编辑以提高清晰度和语言质量，并开发用于转录组分析的代码。所有科学内容在使用该工具/服务之前均由作者自行撰写。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。

方法关键资源表
试剂或资源 | 来源 | 识别符
抗体 | IRDye 680 | RD Donkey anti-rabbit IgG二级抗体 | LI-COR926–68073
IRDye 800 | CW Donkey anti-Mouse IgG二级抗体 | LI-COR926–32212
Anti-ACTB | Mouse单克隆抗体 | Proteintech 66009-1-IG
Rabbit Anti-UNC-60A抗体 | Shoichiro Ono Lab
细菌和病毒菌株 | OP50 | CGCN/A
HT115 | CGCN/A
化学品、肽和重组蛋白 |
+/-5-Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Spectrum Chemical F2026-10
GLABOSE 1 | BIOTECHNOLOGY GRAW | WR97062–250
Gibco Bacto? Peptone | VWR76628–830
Carbenicillin (Disodium) | GOLD BIOTECHNOLOGY | INC-103-25
Agar, BD Difco | VWR90000–764
IPTG | Apex18–242
Luria Bertani Broth, Miller | VWR95020–778
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich T7660-5
Gambion TRIzol Reagent | Thermo Scientific 155960
CHOLESTEROL HIGHLY PU 5 | VWR80057–932
Calcium chloride dihydrate | VWR97061–904
Sodium Chloride | EMD Millipore SX0420-5
Potassium Phosphate Mono | VWRREM-PX1565-5
Magnesium sulfate heptahydrate | VWRREM-PX0070-3
Potassium phosphate dibasic | VWRREM-PX1570-2
Sodium Phosphate Dibasic | VWR71003–474
Sodium Hydroxide | VWRBDH9292-5
Sodium Azide | VWR97064–646
Chloroform | Sigma-Aldrich 34854
Isopropanol | Fisher Scientific AC327272500
Hoechst | Invitrogen 33342
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich M3148-100
甘油 1L | VWR97063–892
Bromophenol blue | Thermo Scientific A18469.09
Latrunculin A | 无
Jasplakinolide | 无

关键商业试剂和实验模型/参与者详细信息
QuantaBio Extracta Plus RNA试剂盒 | QuantaBio 76492–576
沉积数据 | 无
批量RNA-seq | 本文 E-MTAB-16193
snRNA-seq | 本文 E-MTAB-16195
HRS GWAS | Health and Retirement Study (HRS) dbGaP研究 访问号：phs000428.v2.p2
ELSA GWAS | English Longitudinal Study of Aging EGAS00001001036
daf-2 RNAi一致性 | Ristow Lab GSE36041

实验模型：生物体/菌株
C. elegans：Bristol (N2)菌株作为野生型（WT） | CGCN
C. elegans：SS104: glp-4(bn2) | ICGC
C. elegans：ML2615: dlg-1_mc103[dlg-1:gfp] | XCGC
C. elegans：RHS41: unc-119(ed3) III; uthSi7[myo-3p:LifeAct:mRuby:unc-54 3′UTR:cb-unc-119(+)] | IVCGC
C. elegans：RHS42: unc-119(ed3) III; uthSi10[col-19:LifeAct:mRuby:unc-54 3′UTR:cb-unc-119(+)] | IVCGC
C. elegans：RHS43: uthSi13[gly-19p:LifeAct:mRuby:unc-54 3′UTR, cb-unc-119(+)] | IVCGC
C. elegans：AGD1395: uthIs393[vha-6p:Q40:YFP+rol-6(su1006)] | Dillin lab
C. elegans：RHS80: rmIs110[rgef-1p:Q40:YFP] | CGCAM101
C. elegans：RHS75: rmIs133[unc-54p:Q40:YFP] | CGCAM141
C. elegans：MAH349: sqls35[pMH951/sqst-1p:sqst-1:gfp+pMH876/unc-122p:rfp] | CGCAM141
C. elegans：MAH1192: atg-3(bp412) IV; sqls35[sqst-1p:sqst-1:gfp+unc-122p:rfp] | CGC
C. elegans：MAH1192 | Hansen Lab
C. elegans：DA2123: adIs2122[lgg-1p:GFP:lgg-1 + rol-6(su1006)] | CGC
C. elegans：RHS191: uthSi17[myo-3p:MLS::GFP(65C):unc-54 3′UTR, cb-unc-119(+)] | CGC
C. elegans：RHS192: uthSi83[col-19p:MLS::GFP(65C):unc-54 3′UTR, cb-unc-119(+)] | CGC
C. elegans：RHS193: uthSi80[vha-6p:MLS::GFP(65C):unc-54 3′UTR, cb-unc-119(+)] | CGC
C. elegans：RHS193: uthSi80[vha-6p:MLS::GFP(65C):unc-54 3′UTR, cb-unc-119(+)] | CGC
C. elegans：AM140: rmIs132[unc-54p:Q35:YFP] | CGCAM140
C. elegans：NR222: rde-1(ne219) V; kzIs9[(pKK1260) lin-26p:NLS::GFP + (pKK1253) lin-26p:rde-1 + rol-6(su1006)] | CGC
C. elegans：VP303: rde-1(ne219) V; kbIs7[nhx-2p:rde-1 + rol-6(su1006)] | CGC
C. elegans：WM118: rde-1(ne300) V; neIs9[myo-3:HA::RDE-1 + rol-6(su1006)] | CGC
C. elegans：WM118 | Hansen Lab
C. elegans：MAH677: sid-1(qt9) V; sqIs71[rgef-1p:GFP + rgef-1p:sid-1] | CGC
C. elegans：RHS10: ldrIs1[dhs-3p:dhs-3:GFP + unc-76(+)] | Oorloff等人
Oligonucleotides | Primer: act-1 正向: CTCTTGCCCCATCAACCATG | IDT
Primer: act-1 反向: GAGATCCACATCTGTTGGAAGG | IDT
Primer: arx-2 正向: CATGGTTTTCCTTGGAGGAGC | IDT
Primer: arx-2 反向: GCTTTGATTCCAAGTTTGGCC | IDT
Primer: lev-11 正向: CCTTAAAGCACGCCAATTACAAG | IDT
Primer: lev-11 反向: TCAGTCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAT | IDT
Primer: unc-6RNAi平板上接种了HT115 E. coli K菌株，这些菌株携带pL4440空载体（EV）或表达针对目标基因的双链RNA的pL4440构建体（所有条件均见图例说明，本研究中使用的所有RNAi序列在下方提供）。除非另有说明，否则所有实验中的动物均在20°C下培养。第1天的成年动物定义为怀孕的成年动物，即具有完整卵囊的动物，这大约发生在20°C下L1阶段后的3天（72小时）。本研究中使用的所有RNAi序列见表S12，所有使用的菌株见表S13。

方法细节：
所有高分辨率显微镜观察都是在图表和图例中指定的年龄下的活体动物上进行的。动物通过标准的漂白协议进行同步处理，并从成年第一天开始在添加了FUDR的RNAi平板上培养至所需年龄，具体方法如前所述。为了制作FUDR平板，将100 μL浓度为10 mg/mL的FUDR点在接种了所选RNAi细菌的RNAi平板上。在添加FUDR之前，让细菌在RNAi平板上至少生长24小时。对于成像，从平板中取出动物并直接安装到显微镜载玻片上，然后加入M9 + 0.1 M亚硝酸钠以麻醉动物。对于标准宽场成像，使用配备63x/1.4 Plan ApoChromat物镜、标准dsRed滤光片（11525309）和GFP滤光片（11525314）的Leica Thunder Imager相机、Leica LED5光源，并通过LAS X软件进行成像。对于共聚焦显微镜成像，使用配备白光激光源和405 nm激光源的Stellaris 5共聚焦显微镜，并通过LAS X软件进行成像。对于所有显微镜观察，显示了三个独立生物学重复实验的代表性图像。

对于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的全身成像，将动物排列在没有细菌的NGM平板上。将约10-12条线虫放入M9 + 0.1 M亚硝酸钠中麻醉，然后以咽部朝上的方式排列，并使用由LAS X软件控制的Leica M205FCA自动荧光立体显微镜进行成像。

C. elegans批量RNA-seq：
在22°C下培养的glp-4(bn2)动物成年第一天进行RNA分离，以确保没有后代或配子影响转录变化。这一点非常重要，因为我们在本手稿中展示了干扰肌动蛋白功能会对繁殖产生显著影响，因此去除后代对于全动物分析至关重要。大约使用1000条线虫来收集RNA。具体操作是：用M9清洗平板上的线虫并立即放入Trizol溶液中。RNA分离通过液氮/37°C的珠子浴循环进行3次冷冻/解冻。最后一次解冻后，按1:5的氯仿:Trizol比例加入氯仿，然后通过重凝胶锁管（VWR, 10847-802）离心分离水相。将水相与异丙醇按1:1混合，然后加入QuantaBio Extracta Plus RNA试剂盒（76492-576）柱中，按照制造商的说明进行RNA纯化。

对于批量RNA-seq、文库构建和测序，我们在Novogene公司使用Illumina NovaSeq6000仪器进行，采用poly(A)选择、首链合成和配对末端的工作流程。每种条件分析三个生物学重复实验。使用Trim Galore v0.6.7–1.7修剪低质量读段和接头序列。使用STAR-2.7.3a将读段比对到WBcel235基因组，并使用Subread v2.0.3生成原始计数矩阵。使用DESeq2计算差异基因表达，使用sva v3.54.0校正批量效应和非生物变异源。通过WormEnrichr进行GO富集分析。Upset图使用R包UpSetR版本1.4.0绘制。Fisher精确检验使用R包ggstatsplot版本0.13.1的ggbarstat()函数进行。

### 预测生物年龄：
首先将原始计数转换为每百万计数（CPM），然后使用BiT年龄出版物中提供的代码和弹性网络系数计算预测的生物年龄。

C. elegans qPCR：
使用Nanodrop One分光光度计（ThermoFisher）对分离出的总RNA进行定量，随后使用SuperScript IV VILO Master Mix（Thermo Fisher）反转录为cDNA。mRNA转录本使用Quant Studio 3实时PCR系统（Thermo Fisher）和Fast SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher）进行定量。循环时间和参数根据Fast SYBR制造商的协议确定。目标基因的表达量以对照组为基准进行归一化。

### 线虫的核分离准备：
无生殖细胞的突变体glp-4(bn2)线虫在允许的温度15°C下培养至怀孕成年阶段。通过已建立的基于漂白的方案分离卵子。让卵子在20°C的M9中过夜同步到L1阶段，然后接种到含有10X浓缩EV或RNAi细菌的60 mm RNAi平板上，每个平板上的细菌浓度为250条线虫。线虫在限制温度22°C下培养至成年第一天，然后收集用于核分离。每种条件大约收集3,000条线虫。

### 核分离：
所有缓冲液在收集线虫前新鲜配制并置于冰上。所有移液器吸头、试管和研钵均用匀浆缓冲液或含BSA的PBS冲洗，以减少核细胞对表面的附着。收集的线虫用15 mL试管中的M9冲洗3次，然后转移到1.5 mL试管中。在4°C下使用摆动桶离心机离心，去除上清液后将样品置于冰上。向线虫中加入100 μL匀浆缓冲液，然后用电动研钵研磨45秒。再加入800 μL匀浆缓冲液洗研钵。将样品转移到无菌的1 mL Dounce匀浆器中（Wheaton, 357538）。使用松动的研钵对样品进行20次研磨，然后用50 μL匀浆缓冲液冲洗研钵。接着使用紧密的研钵再进行20次研磨，再用50 μL匀浆缓冲液冲洗研钵。将裂解液过滤到35 μM细胞滤膜管中，再通过Flowmi细胞滤膜（Bel-Art, H13680-0040）将裂解液转移到1.5 mL试管中。使用摆动桶转子在4°C下以800 xg离心10分钟，去除上清液，将沉淀物重新悬浮在含0.5% BSA和RNase抑制剂的500 μL PBS中，避免形成气泡。沉淀物完全重新悬浮后，再次通过Flowmi细胞滤膜过滤，并转移到流式细胞仪试管中。将20 μL过滤后的样品转移到含有180 μL含0.5% BSA和RNase抑制剂的PBS试管中，作为荧光激活细胞分选（FACS）的未染色对照。剩余样品在冰上用Hoechst（Invitrogen, 33342）以1:1,000的工作浓度染色。根据前向散射面积（FSC-A）将约200,000至300,000个Hoechst阳性事件分选到1.5 mL试管中。将分选的核细胞在4°C下使用摆动桶转子以1,000 xg离心10分钟。去除上清液，将核细胞重新悬浮在含0.5% BSA和RNase抑制剂的45 μL PBS中，并用移液器 Pipette 混匀。将2 μL重新悬浮的核细胞稀释后，使用血细胞计数器根据Hoechst荧光进行计数。

### snRNA-seq：
将18 μL浓度为1,000个核细胞的样本提供给Janelia Research Campus定量基因组学核心实验室，并使用10X Genomics Chromium Single Cell 5’ (v2 Chemistry Dual Index)流程进行处理。snRNA测序由Novogene公司使用他们的NovaSeq XPlus 25B Premade-10X 5 prime Single Cell Transcriptome Library流程完成。

### snRNA-seq预处理：
原始读段使用Cell Ranger（9.0.0, 10X Genomics）处理。测序读段与使用C. elegans基因组WBcel235.dna.toplevel.fa和WBcel235.113.gtf文件生成的蛋白质编码参考序列进行比对。输出的原始和过滤后的特征条形码矩阵使用Seurat（4.4.0）加载到R（4.4.3）中，并根据先前发布的流程进行处理。使用SoupX（1.6.2）对矩阵进行去污染处理，并将其转换为Seurat对象（SeuratObject_4.1.4），阈值设置为至少3个细胞和至少100个特征。通过子集筛选去除异常值，筛选条件包括少于100-8000个特征、少于5%的线粒体基因和少于20,000个计数。使用SCTransform（0.4.1）对数据进行归一化，并使用DoubletFinder（2.0.3）和SCDS（1.22.0）R包去除重复读段，比例依据10X Genomics用户指南（CG000204 Rev D）估计。

### snRNA-seq聚类和细胞类型注释：
使用SCTransform对单细胞进行缩放，变量设置为5000个特征和nFeature_RNA及percent.mito。使用vst方法选择2000个变量特征进行整合。使用rpca减少法确定整合锚点，k.anchor设置为20。使用 Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）方法进行降维，基于主成分分析的50个维度。使用默认的Louvain算法、100个随机起点和0.8的分辨率识别簇。使用SingleR包（2.8.0）进行细胞类型注释，并参照之前的snRNA-seq数据集中的典型细胞类型进行注释。然后将簇注释为占簇超过50%的组织或基于簇内两种最大细胞类型的比例。

### 批量RNA-seq反卷积和差异表达分析：
使用InstaPrism包（0.1.6）对批量RNA-seq计数进行反卷积，snRNA-seq数据采用与批量RNA-seq相同的菌株和条件获得。使用Instaprism get_Z_array()函数对特定细胞类型的基因表达计数进行反卷积。反卷积后的细胞类型特异性基因计数进行四舍五入，并使用DEseq2（1.46.0）和lima（3.62.2）包进行差异表达分析，以校正非生物变异源和批量效应。

### Western blot：
每种条件收集100条线虫，每条线虫加入10 μL M9缓冲液。向每个样品中加入15 μL SDS样品缓冲液（0.2M Tris-HCl、2.86 M 2-mercaptoethanol、4.3 M甘油、6 mM bromophenol blue、277 mM SDS），然后混合。样品在95°C下煮沸3次，每5分钟一次，然后在?80°C下冷冻10分钟。裂解后，将样品离心30秒以沉淀不溶性碎片。每个孔加入20 μL样品到4–15%的凝胶梯度中。此外，还加入5 μL Kaleidoscope蛋白梯度。蛋白质通过电泳分离，然后使用Criterion blotter（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用LI-COR Intercept阻断缓冲液（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE）封闭，并在4°C下与一抗孵育过夜。洗涤后，膜与IRDye标记的二抗（800CW驴抗鼠和/或680CW驴抗兔；两者稀释比例为1:10,000）孵育。蛋白质条带使用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统可视化。Western blot信号使用ImageJ进行量化。

### C. elegans拍打实验：
根据图例中指定的年龄，在含有成年动物的平板上加入100 μL M9溶液，并使用Leica K5相机通过Leica M205FCA立体显微镜拍摄30秒的视频。拍打程度通过观察10秒内的动作来衡量，一次拍打定义为动物身体至少50%的部分朝向相反方向弯曲。

### C. elegans繁殖力实验：
将10条L4阶段的动物转移到接种有EV培养物的单独平板上。每12小时将动物转移到新平板上，原始含有卵子的平板在15°C下保存2-3天，直到计数和评分活后代。将所有后代平板上的动物数量累加起来，得到每个个体的繁殖力。

### C. elegans寿命实验：
在20°C的标准RNAi平板上进行寿命实验。将第1天的成年动物放置在含有FUDR的RNAi平板上，并每天评分活力。如果动物在头部和尾部被铂丝刺激后仍没有任何移动迹象，则被判定为死亡。如果动物出现与年龄无关的死亡现象，包括内脏器官外露（胎生）、肠道从外阴处渗出、爬上墙壁等，则被标记为“审查中”。所有统计测试均使用Prism7软件中的Log Rank测试进行，相关统计数据见表S1。

对于LatA和Jasp的寿命研究，动物从L1阶段开始在标准的RNAi培养基上饲养，成年后第1天转移到含有特定化合物的RNAi培养基上。LatA和Jasp按图例中指示的浓度直接加入NGM RNAi培养基中。DMSO作为溶剂对照使用。寿命每2天测量一次，方法与标准寿命测量相同。

**C. elegans肠道检测**
C. elegans从孵化开始在含有80% RNAi细菌和20%表达mCherry的HT115细菌的混合物中培养。在成年后的第1天、第5天和第9天收集这些虫子进行分析。每个时间点将虫子用M9缓冲液清洗三次以去除外部细菌，然后转移到含有OP50的培养板上2小时，以清除肠道中的非附着细菌。清洗结束后，将虫子排列好进行成像。每个条件每个时间点重复三次实验，每次12条虫子，将其置于0.1M叠氮化物溶液中，并使用Leica M205立体显微镜在适当的荧光设置下观察mCherry信号。

**C. elegans海马测定**
将成年的第1天动物用M9缓冲液从培养板上洗下，转移到不含细菌的NGM培养板上。然后从该培养板上吸取10–15条虫子至Seahorse XF96微孔板的每个孔中，确保不含后代。使用配备XFe96传感器盒的Seahorse XFe96分析仪测量基础耗氧率，测量过程包括2分钟混合、30秒等待时间和2分钟测量，共进行6次测量。之后将虫子暴露于50 mM叠氮化物中以测量非线粒体呼吸速率，测量过程同样包括2分钟混合、30秒等待时间和2分钟测量。

**C. elegans自噬检测**
通过在成年后的第1天，检测DA2123和RD202品系的身体壁肌肉、近端肠道细胞和皮下缝合细胞中的GFP::LGG-1/Atg8自噬泡点来监测自噬现象。动物在含有EV、act-1（1:9比例，OD600值匹配）、arx-2、unc-60或lev-11的RNAi培养基上20°C条件下饲养。为了成像和自噬泡点计数，将动物固定在含有0.1%叠氮化物的M9培养基中的3%琼脂凝胶上。使用Zeiss Imager Z1显微镜（配备apotome 2、Hamamatsu Orca Flash 4LT相机和Zen 2.3软件）进行观察和分析。

**latrunculin A（Lat A）的化学分离与纯度**
海洋海绵C. mycofijiensis的生物材料通过潜水在瓦努阿图收集，分类鉴定通过与UC Santa Cruz海绵库中的参考样本进行比对完成。如有需要，可提供凭证样本和水下照片。C. mycofijiensis的提取物按照先前报道的方法处理。脂肪二氯甲烷提取物（FD）用于纯化Lat A的HPLC分离。HPLC纯化在半制备型柱（Phenomenex Inc. Luna? 5 μm C18(2) 100 ? 10 × 250 mm）上进行，同时使用4.0 × 3.0 mm的C18保护柱和注射盒（支架部件编号：KJ0-4282，注射盒部件编号：AJ0-4287，Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA）。采用反相线性梯度（30:70 CH3CN/H2O，50分钟内从0%升至80%，61分钟后恢复到100% CH3CN，62至73分钟期间恢复到30:70）。化合物检测通过单波长（λ max = 230 nM）使用Spectroflow 783可编程吸光度检测器进行（检测器部件编号：9000-7831）。Lat A大约在52分钟时开始洗脱。纯化后的化合物在N2气流下干燥，储存在透明小瓶中，并密封在真空干燥箱中。使用Bruker 500 MHz Avance NEO光谱仪进行1H NMR分析，确认化合物纯度高于95%，该光谱仪配备Prodigy宽带观察cryoprobe。

**jasplakinolide（Jasp）的化学分离与纯度**
海洋海绵J. splendens的样本在斐济收集，分类鉴定方法同前文。脂肪二氯甲烷提取物（FD）用于纯化Jasp的HPLC分离。HPLC纯化在制备型柱（Phenomenex Inc. Luna? 10 μm PREP C18(2) 100 ? 250 × 21.2 mm）上进行，同时使用10.0 × 10.0 mm的C18保护柱和注射盒（支架部件编号：AJ0-9281，注射盒部件编号：AJ0-7221，Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA）。采用反相线性梯度（50:50 CH3CN/H2O，30分钟内从0%升至100%，31至38分钟保持100% CH3CN，39至48分钟恢复到50:50）。化合物检测通过单波长（λ max = 230 nM）使用Spectroflow 783可编程吸光度检测器进行（检测器部件编号：9000-7831）。Jasp大约在36分钟时开始洗脱。纯化后的化合物在N2气流下干燥并储存在透明小瓶中。使用Bruker 500 MHz Avance NEO光谱仪进行1H NMR分析，确认化合物纯度高于95%，该光谱仪配备Prodigy宽带观察cryoprobe。

**研究人群**
本研究使用了独立发现样本和复制样本。发现样本来源于美国健康与退休研究（HRS），这是一项针对美国50岁及以上成年人的全国代表性纵向调查，自1992年起每两年进行一次访谈。HRS涵盖了全国范围内的家庭，共有超过36,000名参与者。用于评估步态速度下降的GeneWAS子样本限制在3,684名受访者（其中59.58%为女性），他们满足以下条件：（1）年龄≥50岁；（2）至少完成两次步态速度测量；（3）步速≤2.5 m/s；（4）被归类为非西班牙裔白人，以消除人群分层问题；（5）有可用的遗传信息。复制样本来源于英格兰老龄化纵向研究（ELSA），作为HRS的配套研究，针对英格兰50岁及以上的居民，得到了伦敦多中心研究伦理委员会的伦理批准和书面同意。该研究始于2002年，共有11,391名参与者，此后每两年进行一次随访。样本纳入标准与HRS相同，当前研究中有6,182名ELSA参与者（54.08%为女性），他们的步态速度在2002年至2018年间至少被评估了两次。

**GWAS基因分型数据**
基因型数据来自国家生物技术信息中心的基因型和表型数据库（dbGaP）。HRS参与者的DNA样本在2006年和2008年兩次收集，由NIH遗传疾病研究中心（CIDR；约翰霍普金斯大学）使用Illumina（圣地亚哥，CA）的HumanOmni2.5阵列进行基因分型。两个阶段的原始数据被合并处理。HRS遵循标准质量控制措施，排除了数据异常的样本和标记，包括CIDR技术过滤器，移除了重复的SNP、调用率≥2%、不一致的调用超过4次、孟德尔错误超过1次、偏离哈代-温伯格平衡（在欧洲样本中p值<10-4）以及性别差异等位基因频率≥0.2的SNP。这些标准应用于染色体7上的基因区域（nc_000001.10）：actb区域内共有5,566,040-5,603,533个SNP，其中18个次要等位基因的频率大于或等于0.01。为了评估与步态速度下降相关的关联变异，进行了聚类分析，首先排除了非西班牙裔白人群中的冗余相关效应和连锁不平衡（ld）。选择每个相关SNP组中最显著的SNP，共得到12个SNP（见表S2中的粗体SNP）。

**ELSA基因型数据**
ELSAs的基因型数据分析由伦敦大学学院（UCL）基因组学研究所使用Illumina的HumanOmni2.5–8阵列完成。DNA样本来自2004年和2008年采集的血液样本。由于两项研究设计相似（共有2,368,902个共同标记），因此对ELSA数据应用了与HRS相同的质量控制程序，但UCL排除了调用率超过5%的SNP（而非2%）。最终得到1,372,240个欧洲血统个体的数据，其中6,182人有表型信息。

**表型构建**
表型构建旨在计算正常年龄相关肌肉功能随时间的衰减情况。通过合并多个调查年份的数据，对相同个体进行多次评估，并参考文献中关于基于人群的老化调查共识进行计算。步态速度通过测量走完98.5英寸（250厘米）距离所需的时间来评估。HRS中65岁及以上的受访者完成了两次计时行走测试，两次测试的平均值转换为每秒米数（基线平均值=0.79，标准差=0.25）。步态速度下降的表型通过SAS 9.4中的混合效应模型计算得出，考虑了性别、首次评估时的年龄和随访年数等变量。ELSAs数据也采用了相同的程序。

**GeneWAS分析**
GeneWAS采用加性模型进行一系列线性回归分析，同时调整了相关协变量和人群分层指标。当不同亚群体之间的相关变量存在差异时，可能会导致假象的遗传关联。为减少这种第一类错误，我们根据主成分分析（PCA）得出的潜在因素调整了GeneWAS分析，以考虑人群亚结构。PCA过程中，前两个特征值解释的遗传方差占比小于4.5%，后续增加的组件（3-8个）仅略微增加了约1.0%的方差。基于这些分析，我们采用了一种既不忽略人群亚结构也不过度校正的策略，在所有HRS数据分析中调整了前四个主成分（PC）。由于ELSAs数据中的祖先同质性，未使用额外的PC。所有GeneWAS分析均使用PLINK 2.0软件完成。

**SNP评估**
在GeneWAS中，我们通过p值评估SNP关联。由于本研究涉及的SNP数量和主要表型数量较多，严格的Bonferroni校正会导致多重检验校正后的p值阈值降至0.0028（对于18个检验）。然而，这样的Bonferroni校正过于保守，因为SNPs之间存在相关性，且采用了交叉验证方法。为解决SNPs之间的相关性，我们采用了聚类方案并计算了经验p值阈值。聚类是通过随机打乱SNPs和表型之间的关系来实现的，然后将随机打乱后的数据的p值与未打乱数据的p值进行比较。这个过程重复多次，以确定统计结果仅凭偶然性达到显著性的可能性。因此，在使用PLINK和max(T)选项进行10,000次排列时，观察到步态速度下降的p值阈值为0.0319，用于确定基因组的显著性。对于SNP比较，我们使用了R软件。Genotype-Tissue Expression (GTEx)数据库是公开可用的最全面的组织特异性基因表达数据资源，用来评估SNP在基因中是否具有调控功能。我们将顶部SNP输入GTEx以评估其与基因表达差异的关系。

### 肌肉肌动蛋白破坏的量化
为了量化肌肉肌动蛋白，我们手动计算了每个动物中肌动蛋白纤维有缺陷的肌肉细胞数量。如果任何可见的纤维显示出可观察到的表型差异（例如，纤维磨损、不均匀的纤维、断裂的纤维等），则将肌肉细胞视为肌动蛋白有缺陷。计算每张图像中肌动蛋白破坏的肌肉细胞百分比与总肌肉细胞数量的比例，数据以每个生物学重复实验为一个数据点的形式呈现。统计分析使用GraphPad Prism软件中的参数学生t检验进行。肠道肌动蛋白结构通过1-3的盲法手动评分进行评估，其中1表示正常的野生型形态，2表示部分受损结构，3表示严重受损的结构。

### 皮下肌动蛋白结构的量化
在Fiji软件中，通过计算荧光区域占总图像面积的百分比来量化皮下肌动蛋白结构（数据S1A）。通常，此宏程序首先清除“结果”表，启用批处理模式以加快无窗口处理速度（通过阻止图像在屏幕上闪烁），并设置一次测量字段（面积、平均值、最小值、面积分数、3个小数位）。然后它遍历所有打开的图像（nImages），依次选择每个图像并调用processImage。在processImage内部，它记录新行的开始位置（prevNumResults），并获取图像标题进行标注，切换到通道1（请注意这取决于成像的通道数量，但这应该是最佳荧光通道），将图像转换为8位，并设置自动阈值（“三角形白色”）。Measure记录整个图像的强度统计数据（因此平均值/最小值来自灰度图像），而area_fraction是根据当前阈值计算的（高于阈值的像素比例）。测量完成后，它将文件名写入新添加的行中。所有图像处理完成后，宏程序关闭批处理模式，刷新结果表，提示保存位置，并保存包含每个图像的面积、平均值、最小值和面积分数的计算结果的表格。

### 线粒体形态的量化
为了量化线粒体形态，我们使用了mitoMAPR软件，该软件可以量化多种线粒体形态指标。在这里，我们使用线粒体对象长度和线粒体对象数量/线粒体足迹作为代表性测量指标。融合线粒体的线粒体对象长度通常较高，而碎片化线粒体的线粒体对象长度较低。线粒体对象数量/线粒体足迹测量每单位体积线粒体的不同线粒体对象总数，数量较高表示线粒体更碎片化，而数量较低表示线粒体更加融合。

### 脂质滴的量化
在Fiji软件中，通过在立体镜图像中绘制每个动物的ROI并测量积分荧光强度来量化DHS-3:GFP信号（数据S1B）。此宏程序通过遍历所有当前打开的图像并测量用户绘制的ROI来量化脂质滴信号。它首先关闭任何现有的结果表，通过设置测量参数（面积、平均值、积分密度、3个小数位）并进行一次虚拟测量来初始化一个结果表，然后清除它以准备下一步操作。对于每个图像（nImages），它选择图像，切换到通道2，转换为8位，并略微增强对比度（0.35%饱和度）。它重置ROI Manager，暂停让用户围绕每条蠕虫绘制ROI并将它们添加到ROI Manager中，然后遍历这些ROI。对于每个ROI，它运行Measure（使用当前选择的通道），在结果表中为新行添加标签（如Worm_#_），并更新表格。所有图像/ROI处理完成后，它询问保存位置，并将结果表保存为用户选择的文件夹中的“IntegratedIntensity_Summary_(rep #).csv”文件。

### 肠道侵袭的量化
在Fiji软件中，通过在每个动物周围绘制ROI并测量高于阈值的积分荧光强度来量化肠道侵袭（数据S1C）。此宏程序在每个打开的图像的通道2上测量肠道中的荧光信号，仅使用用户绘制的ROI内的高于设定阈值的像素。它首先关闭任何现有的结果表，初始化测量设置（面积、平均值、积分密度、3个小数位），并进行一次虚拟测量以创建表格，然后清除它。对于每个图像（nImages），它选择图像，切换到通道2，转换为8位（以便阈值在0-255的范围内），并提示用户在每条蠕虫周围绘制ROI并将其添加到ROI Manager中。对于每个ROI，它重新选择通道2，应用固定阈值25-255（以便只计算较亮的像素），保持“限制到阈值”处于活动状态，并运行Measure，生成该蠕虫的面积（ROI上方的面积）、平均值（这些像素的平均强度）和积分密度（面积×平均值）。它为每行添加标签Worm_<#>_，更新结果表，并在所有图像/ROI处理完成后询问保存位置，并将表格保存为“day#_rep#_IntegratedIntensity_Summary_gut_assay.csv”文件。

### 神经元polyQ聚集物的量化
在Fiji软件中，通过在每个单独的动物周围绘制感兴趣区域（ROI）并测量聚集体数量和每个聚集体的大小来量化神经元polyQ聚集体（数据S1D）。类似地，在Fiji软件中，通过测量每张图像中的脂质滴数量和大小以及使用整个图像作为ROI来量化共聚焦图像中的DHS-3:GFP点（数据S1D）。简而言之，此宏程序遍历所有打开的图像，切换到通道3（可以是包含荧光图像的任何通道），并提示用户在ROI Manager中围绕每条蠕虫（对于立体镜图像）或整个帧（对于共聚焦图像）绘制ROI。对于每个ROI，它将该区域复制到新图像中并运行“Clear Outside”以仅保留感兴趣的区域。然后它预处理裁剪图像：转换为8位，进行滚动球背景减法（半径30像素）以去除平滑背景，应用MaxEntropy自动阈值来分割明亮信号，设置黑色背景，转换为二值掩模，并运行快速侵蚀（膨胀）以清除噪声和填充小间隙。接下来，它设置测量参数并调用Analyze Particles……并使用“summarize”功能，该功能将摘要表填充该ROI区域的常用统计信息（例如，计数、总面积、平均大小、%面积）。然后它将“Slice”条目的名称更改为Worm_#_标签，以便可以将结果追溯到每条蠕虫/图像，关闭裁剪图像，并继续处理下一个ROI/图像。完成后，它询问保存位置，并将摘要表保存为“Counts_SummaryTable.csv”文件。

### 自噬点的量化
在体壁肌肉细胞、最靠近肠道的前两到三个细胞或一到三个可见的皮下缝合细胞中手动计数自噬点。每种条件至少对7-10条动物进行成像，结果来自三个独立实验，并使用学生t检验进行分析（GraphPad Prism）。OCR使用Prism7软件绘制，并使用GraphPad Prism进行单向ANOVA统计分析。所有寿命统计测试使用Prism7软件和Log Rank检验进行。繁殖和挣扎实验的数据代表了三个独立的生物学重复实验，使用Prism 7软件生成点图，并使用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析。

### 量化与统计分析
除非另有说明，否则统计分析均使用GraphPad Prism 7（GraphPad软件）进行。批量RNA-seq差异表达分析使用DESeq2进行，批量校正使用SVA。单核RNA-seq的预处理和后续分析在R（v4.4.3）中使用Seurat（v4.4.0）及相关包进行，具体方法详见方法描述。人类基因关联分析使用PLINK v2.0进行，其他统计分析在R中使用方法描述中的包进行。

### 每个实验使用的统计检验
每个实验使用的统计检验在相应的图例中说明。这些包括双尾学生t检验、Welch的双尾t检验、配对t检验、Mann-Whitney检验、单向ANOVA、双向ANOVA、单样本t检验、Fisher的精确检验以及适用于每个数据集的log rank（Mantel-Cox）检验。

### 寿命分析
对于寿命分析，使用log rank（Mantel-Cox）检验比较生存曲线，并在表S1中提供完整的寿命统计信息。批量RNA-seq的差异基因表达分析使用DESeq2进行，显著性阈值在相应的结果、图例和补充表中描述。基因组关联分析使用方法描述中所述的通过排列检验确定的经验显著性阈值进行。

### 数据呈现
除非另有说明，否则所有实验均使用独立的生物学重复实验。数据尽可能以单个生物学重复实验的形式呈现。对于点图，每个点代表一个单独的生物学重复实验或个体动物，如相应的图例所示。误差条表示标准差（SD），除非另有说明。小提琴图显示完整的数据分布。箱形图显示中位数、第一和第三四分位数以及须状线，具体定义见相应的图例。除非另有说明，统计显著性考虑p < 0.05。

### 补充信息
- 下载所有数据：PDF（5.06 MB）
- 文档S1：图S1-S15和表S12、S13
- 电子表格（20.19 KB）：表S1。与图2、8和S1相关的寿命数据的统计分析
- 电子表格（14.36 KB）：表S2。与图9相关的步态速度下降和虚弱相关的SNP
- 电子表格（1.77 MB）：表S3。与图2相关的act-1、arx-2、lev-11和unc-60 RNAi的批量RNA-seq差异表达基因和表达值
- 电子表格（14.63 KB）：表S4。与图2和S14相关的BiTAge预测的转录年龄值
- 电子表格（109.66 KB）：表S5。与图3和8相关的mitoMAPR线粒体形态值
- 电子表格（39.43 KB）：表S6。用于脂质稳态和自噬热图的DEGs
- 电子表格（193.04 KB）：表S7。与图S3、S4和S9相关的批量RNA-seq的GO富集分析的基因本体术语、基因和统计信息
- 电子表格（309.61 KB）：表S8。与图S8相关的匹配参考snRNA-seq反卷积的Spearman相关性
- 电子表格（220.00 KB）：表S9。与图S8、S9和S10相关的组织特异性点图中显示的差异表达基因
- 电子表格（39.46 KB）：表S10。与图S11相关的野生型参考snRNA-seq反卷积的基因本体术语、基因和统计信息
- 电子表格（2.16 MB）：表S11。与图S15相关的Jasplakinolide和Latrunculin A处理动物的批量RNA-seq差异表达基因和表达值

### 数据文件
- 数据S1：用于图像量化的Fiji/ImageJ宏程序，与图1、4、5和S5相关：
- (A) 用于量化皮下肌动蛋白结构百分比荧光面积的宏程序。
- (B) 用于量化DHS-3::GFP积分荧光强度的宏程序。
- (C) 用于量化肠道mCherry积分荧光强度的宏程序。
- (D) 用于量化脂质滴和神经元polyQ聚集体数量及大小的宏程序。