综述：生物医学材料与制备方法用于构建体外神经血管单元模型

《Materials》：Biomedical Materials and Fabrication Methods for Construction of In Vitro Neurovascular Unit Models

　　

体外神经血管单元（NVU）模型对于再现血脑屏障（BBB）转运和神经血管细胞相互作用至关重要。然而，文献仍然碎片化：生物材料化学、制备参数和器官芯片架构通常被孤立评估，而基质性质、加工历史、细胞来源、流动和屏障读数的报告不一致，阻碍了直接比较和可迁移设计规则的提取。为弥补这一空白，本综述将生物材料、制造技术和器官芯片工程整合在一个统一的材料-过程-结构-功能框架内。研究人员将内皮连接、基底膜成分和血管周细胞转化为实验上可操作的材料需求；比较天然、合成、半合成和脱细胞细胞外基质水凝胶；并检查交联、肽功能化、刺激响应性、复合网络形成和制备方法。来自Transwell、微流控、管状、自组装和3D生物打印BBB系统的研究结果用于关联基质刚度、可降解性、配体密度、渗透性、器件体材料和制备途径与屏障成熟度、分析可及性和可重复性。通过定义化学、力学、转运和加工方面的匹配对照和最低报告要求，本综述为下一代BBB模型提供了实用基础，这些模型可以改善药物发现中的渗透性和疗效筛选，再现疾病和患者特异性屏障功能障碍，并支持使用iPSC或患者来源细胞进行个体化反应测试。

2. Material-Relevant Architecture and Research Gaps of the Blood–Brain Barrier
本节将血脑屏障（BBB）解剖结构转化为材料相关要求，重点讨论内皮-基底膜界面和血管周接触。内皮-基底膜界面是BBB模型的最小材料单元，需要低吸附的管腔表面和含有胶原（collagen）、层粘连蛋白（laminin）或蛋白聚糖相关信号的薄粘附性基底侧相。血管周接触要求基质支持周细胞（pericytes）和星形胶质细胞（astrocytes）的相互作用，但不同细胞对屏障诱导和维持的贡献不同。研究人员指出，微胶质细胞和神经元仅在需要免疫重塑或神经血管耦合时添加，且要求可降解或允许神经突生长的基质。当前研究的主要空白包括：天然材料来源和批次不明确、合成系统缺乏配体摩尔浓度和交联度报告、界面厚度和器件刚度未匹配对照、屏障性能报告不一致（如TEER、单个示踪剂等）。未来研究应采用因子设计独立变化化学、刚度、可降解性和细胞组成，并报告完整制备历史。

2.1 Material-Defined BBB/NVU Interfaces: Recent Comparative Studies
近年研究强调界面不是被动的。Choi等使用工程化基底膜增强人iPSC衍生模型的屏障特性；Singh等将干细胞衍生的BBB组分嵌入胶原水凝胶；Augustine等使用光交联GelMA构建疾病导向BBB构建物；Sun等将鱿鱼外套膜脱细胞、脱脂和冻干成多孔支架膜，支持内皮细胞和星形胶质细胞，产生约230 Ω·cm²的TEER。这些研究显示界面厚度、孔结构、配体身份、交联和加工历史应作为独立实验变量。血管周接触方面，Campisi等使用纤维蛋白支持自组装内皮-周细胞-星形胶质细胞微血管网络；Ahmad等使用肽功能化PEG提供化学定义的内皮-星形胶质细胞基质；Nakayama-Kitamura等发现胶原I微纤维通过整合素-β1相关相互作用促进星形胶质细胞存活并增加毛细血管网络形成。这些结果识别了三种不同的材料杠杆，但无法直接排序，因为细胞来源、几何、力学和分析终点不同。

2.2 Gaps and Material-Focused Research Needs
当前研究暴露的主要空白包括：纤维蛋白、胶原、GelMA、PEG和dECM研究使用不同细胞、几何、流动和终点，无法进行材料排名；天然材料来源和批次不明确；合成系统缺乏配体摩尔浓度、转化率和网孔尺寸报告；界面厚度和器件刚度未匹配对照；屏障性能报告不一致。临床相关目标表型是早期低水平BBB渗漏而非灾难性屏障失效。Nation等结合动态对比增强MRI和脑脊液周细胞损伤标志物sPDGFRβ，发现早期认知功能障碍患者的海马毛细血管损伤独立于Aβ和tau状态。Montagne等报告基线sPDGFRβ预测APOE4携带者未来认知下降，并与亲环蛋白A-基质金属蛋白酶-9途径激活相关。未来研究应采用因子设计，独立变化化学、刚度、可降解性和细胞组成，报告完整制备历史，并联合TEER或分子尺寸渗透性系列与连接和转运蛋白标志物。无细胞对照在需要区分水凝胶触发、降解事件或二级网络改变扩散时必不可少。

3. Hydrogel Biomaterials for BBB Models: Chemistry, Preparation, and Functionalization
水凝胶是亲水聚合物链组成的溶胀三维网络，化学配方包括聚合物骨架、可交联基团、交联剂、引发剂、水或培养基，以及细胞指令性体系的粘附肽、可降解序列或细胞外基质（ECM）蛋白。聚合物身份、分子量、浓度、功能化和交联密度共同决定刚度、网孔尺寸、溶胀、降解、配体可用性和溶质扩散。天然蛋白水凝胶包括胶原I、纤维蛋白、明胶或明胶甲基丙烯酰（GelMA）；天然多糖系统包括透明质酸或透明质酸甲基丙烯酰（HAMA）、海藻酸盐和壳聚糖；dECM水凝胶含有组织来源的蛋白质和糖胺聚糖混合物；合成系统包括PEG、PVA、聚丙烯酰胺和PNIPAM。天然基质通常提供细胞结合和蛋白酶重塑基序，但来源、批次、纤维结构、收缩和弱力学降低可重复性。合成基质提供定义且独立可调的化学，但PEG、PVA和聚丙烯酰胺本质上非粘附，需有意添加配体和可降解交联。dECM提供复杂组织线索但组成不确定且依赖过程。杂化互穿网络可平衡生物活性和形状保持，但混合交联反应使因果归因、灭菌和质量控制更困难。

3.1 Hydrogel Chemistry, Preparation, and Peptide Functionalization
制备从溶解或分散聚合物前体、细胞和可选配体在细胞相容条件下开始，随后形成网络。胶原I稀释中和后升温驱动纤维形成；纤维蛋白在凝血酶切割纤维蛋白原时形成；海藻酸盐与Ca²⁺离子交联；壳聚糖/β-甘油磷酸酯通过温度依赖性物理结合凝胶化。GelMA和HAMA先通过甲基丙烯酰化、纯化和冻干，再与光引发剂重新溶解并通过控制光暴露交联。多臂PEG可通过丙烯酸酯光聚合、硫醇-烯偶联或迈克尔加成交联。dECM水凝胶需要组织脱细胞、洗涤、冻干、研磨、酶消化和中和后才能热凝胶化。聚合物浓度、取代度、前体化学计量、引发剂剂量、波长、暴露、pH和温度是材料定义的一部分。生物活性肽如RGD支持整合素介导粘附，IKVAV和YIGSR再现层粘连蛋白信号，基质金属蛋白酶（MMP）可切割序列允许细胞定向重塑。Ahmad等在肽功能化PEG水凝胶中共培养内皮细胞和星形胶质细胞，证明化学定义合成基质可支持BBB相关粘附和通讯。Singh等使用5 mg/mL大鼠尾胶原I水凝胶，与星形胶质细胞混合后在Transwell中凝胶化，表面涂覆胶原IV/纤连蛋白后接种hiPSC衍生内皮样细胞，达到TEER>700 Ω·cm²，限制旁细胞示踪剂并显示功能性转铁蛋白受体和ABCB1转运。Nakayama-Kitamura等比较纤维蛋白与纤维蛋白-胶原I微纤维复合物，发现微纤维增加CD31阳性毛细血管体积至181.9%，胶原IV阳性毛细血管体积至758.8%，星形胶质细胞数量至174.1%。DePalma等通过逐步优化，最终使用0.05%硫醇化透明质酸、1.5% GelMA、15%离子交联VitroGel-IKVAV和0.1% Irgacure 2959，在约300 Pa基质中支持稳定管腔、星状星形胶质细胞、内皮紧密连接和低小分子渗透性至少10天。

3.2 Stimuli-Responsive Hydrogels: Mechanisms and BBB Relevance
刺激响应性水凝胶含有可电离基团、可切割或可逆键、相变聚合物或嵌入式功能粒子，通过定义信号转化。机制包括：热、生化、光、声、电或磁触发被识别；聚合物溶剂化、键状态、粒子极化或超分子结合改变；网络交联密度、网孔尺寸、溶胀、模量或降解速率变化；产生可测量输运、释放或细胞-基质响应。温度响应性水凝胶通过温度依赖性溶胶-凝胶或体积相变工作。低临界溶解温度（LCST）系统如PNIPAM，其均聚物转变在约32 °C，可通过自由基聚合、可控自由基聚合或共聚物/复合物制备。Belyaeva等合成PNIPAM并接枝到纤维素纳米晶体，支持原代脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，但作为脑相容性植入物而非灌注BBB模型评估。Promdontree等结合5% N-异丙基丙烯酰胺、壳聚糖和纤维素纳米晶体，光聚合后体积相变温度在34-38 °C。生化响应性网络如MMP敏感肽可被切割扩大网孔或释放因子；Liu等自组装含有MMP-2可切割序列PLGLAG和VEGF模拟肽QK的肽-两亲纳米纤维，MMP-2增加QK释放，在脑缺血/再灌注模型中增加VE-cadherin和ZO-1并减少BBB渗漏。外部驱动凝胶如光响应性水凝胶要求凝胶形成后变化；Fan等将透明质酸功能化并用葫芦脲（CB8）超分子交联，掩膜UV暴露驱动[2+2]光二聚，局部转换可逆接点为共价键并空间调谐粘弹性和淋巴管形成。超声响应性复合材料如Wang等分散KNN压电纳米晶体和还原氧化石墨烯在明胶/PVA基质中，超声增强电动力学和血管生成反应，但模型针对糖尿病伤口再生而非BBB转运。当前BBB直接体外验证仍缺乏，最有用的实验是比较响应性和非响应性基质在匹配基线模量和配体密度下，施加相同触发，量化网络力学、无细胞示踪剂扩散、TEER、尺寸依赖性渗透性、连接连续性和转运蛋白功能。

3.3 Composite and Interpenetrating-Network Hydrogels
复合水凝胶通过将初级水溶胀网络与至少一个第二材料相组合获得，其中第二相功能仍可识别。制备路线包括：一锅混合、正交共交联、顺序网络逐网络制备、以及预成型纤维或微凝胶机械嵌入。互穿聚合物网络（IPN）包含两个连续交联网络，半IPN包含一个交联网络和一个缠结线性聚合物。所获性质取决于添加相：PEGDA或其他共价合成网络通常增加尺寸稳定性、抗细胞介导收缩和模量调谐范围；胶原、纤维蛋白或明胶提供整合素结合和蛋白酶可重塑位点；透明质酸增加保水性和中枢神经系统ECM生化相关性；纤维引入各向异性和接触引导；微凝胶可创建互连大孔。Diaz-Lasprilla等使用顺序网络方法制备胶原I/纤维蛋白/HA/PEGDA mIPN，通过增加纤维蛋白浓度提高复数模量，支持至少95%星形胶质细胞活性。Nakayama-Kitamura等将胶原I微纤维与纤维蛋白混合，增加CD31和胶原IV阳性毛细血管体积。DePalma等使用硫醇化HA和GelMA光交联，结合IKVAV功能化VitroGel离子交联，改善管腔形状保持和细胞-基质支持。这些例子也定义了必要对照：更硬或更稳定的复合物不自动成为更好的BBB基质，需比较初级凝胶与每个添加相及最终复合物，报告混合顺序和固化条件，测量流变、溶胀、微观结构和无细胞渗透性。

3.4 Multi-Material Integration on a Chip
BBB器件通常需要刚性、光学可及的灌注体、薄血管界面和更软的实质水凝胶。多材料制造通过顺序浇铸、表面键合、牺牲模板、嵌入式打印或多喷嘴生物打印解决此不匹配问题。材料间界面仍是关键失败点：分层、未固化低聚物、差异溶胀和非特异性吸附可改变流动或输运。因此，应报告键合化学、可提取物测试、培养条件下溶胀和界面渗漏。水凝胶路线应根据实验背景选择：中和胶原和凝血酶交联纤维蛋白廉价、细胞相容且易于平行浇铸，适合探索性细胞-基质研究；PEG和肽定义网络提供更高化学可重复性，适合因子或多孔筛选；GelMA和HAMA处于中间位置，光固化支持图案化和批量制造；刺激响应性和复合/IPN系统在动态重塑、释放或力学增强为问题时最有用，但触发、交联步骤和输运混杂因素使其不适合常规高通量筛选。DLP提高几何可重复性和平行特征生成，而挤出/同轴打印实现更高细胞密度和多材料放置但分辨率较低、剪切相关变异性较大。

4. Fabrication Strategies for Engineered In Vitro BBB Models
体外BBB模型根据是否提供流体流动和剪切应力分为静态和动态模型。静态培养系统无灌注或连续流动，动态模型利用泵模块产生稳态灌注。理想模型应再现：3D血管样管状结构、神经血管细胞三围共培养、细胞间通讯、流体剪切应力、薄基底膜（BM）和选择性大分子渗透性。当前工程化BBB平台分为四大类：3D细胞球体模型、Transwell基系统、微流控BBB芯片和3D生物打印BBB构建物。

4.1 Three-Dimensional Spheroid Models
人BBB类器官通过微血管细胞迁移、增殖和自发组织形成3D结构，再现细胞间连接蛋白、转运蛋白和载体蛋白表达。Cho等将脑微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞接种在低粘附ECM基质上生成致密固体3D球体，其中星形胶质细胞核心被内皮细胞和周细胞外层包围。Nzou等建立包含人脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和神经元的3D球体。球体模型的优势在于所有细胞亚群间广泛的直接细胞-细胞接触。局限性包括：实时检测和追踪球体核心技术困难、无法再现生理血流和剪切应力、批次间可重复性差。

4.2 Transwell-Based Platforms
Transwell格式由多孔聚合物膜（如PC、PET、PTFE）分隔的顶端和基底侧隔室组成。膜聚合物、厚度、孔径和孔隙率决定可用粘附面积、内皮与血管周细胞距离以及分子输运阻力。Stone等使用12 mm胶原涂层插入物，基底表面涂覆聚-L-赖氨酸，发现孔径从0.4增至3.0 μm增加TEER并改善细胞接触。Kim等将永生化人脑内皮细胞和星形胶质细胞与Matrigel混合，30分钟内组装简化3D Transwell共培养。Singh等将约0.3 mL的5 mg/mL胶原I水凝胶置于0.4 μm插入物中，表面涂覆胶原IV/纤连蛋白后接种hiPSC衍生内皮样细胞，达到TEER>700 Ω·cm²，但TEER在10天内下降，最可靠窗口为24-72小时。Harding等保留标准Transwell插入物并安装在定制毫流控器件中，允许在生理剪切下进行内皮-星形胶质细胞-周细胞共培养。Choi等用超薄ECM水凝胶工程化基底膜替换常规厚插入物界面，由稀疏电纺纳米纤维支架支撑，约500 kPa界面支持iPSC衍生脑内皮细胞，具有强物理屏障和流出泵功能。这些研究建立Transwell模型与生物材料之间的联系：聚合物插入物提供几何和力学支持，吸附蛋白层提供粘附信号，添加水凝胶提供三维力学和扩散阻力，灌注适配器提供剪切。

4.3 Microfluidic BBB Chips
微流控BBB芯片通过模制壁、多孔膜、水凝胶界面、圆柱管腔或自组装血管将灌注内皮隔室与一个或多个血管周隔室耦合。架构决定细胞-细胞距离、扩散路径、壁剪切、采样通道和与每种细胞群体接触的生物材料类型。Ahn等使用等离子键合PDMS层和玻璃支撑，7 μm PC膜（8 μm孔）和下层Matrigel，灌注内皮通道于16 μL/min（约4 dyn/cm²）。Bang等将PDMS复制品键合到玻璃上，注入凝血酶交联纤维蛋白混合物（含内皮细胞和成纤维细胞），允许可灌注网络自组装，随后在神经侧加载神经元和星形胶质细胞，纤维蛋白基质支持VEGF梯度驱动星形胶质细胞迁移和直接血管接触。Wevers等使用相导流将胶原I限制在40个平行芯片的中间通道，涂层内皮通道以减少生长因子Matrigel，接种星形胶质细胞/神经元和脑内皮细胞，在摇动平台上产生双向灌注。这些芯片设计不可互换：膜厚度主导第一个，纤维蛋白重塑和网络变异性主导第二个，胶原壁完整性和静水摇动主导第三个。

4.3.1 Parallel Microchannel-Separated Barrier Models
平行通道模型将血管和神经通道并排放置，由微缝隙或柱分隔。Deosarkar等制造新生儿B3C作为光学透明PDMS芯片，两个血管通道围绕组织隔室，灌注改善屏障特性。Prabhakarpandian等使用并排PDMS SyM-BBB使内皮细胞暴露于流动，同时通过相邻隔室提供星形胶质细胞条件培养基，报告增加紧密连接表达和限制性屏障。PDMS的缺点包括：药物吸收、非特异性蛋白吸附、未交联低聚物浸出、蒸发、等离子氧化后短暂亲水性、溶解气体控制差。玻璃具有低吸附、稳定光学和化学抗性；PMMA、COC和COP可通过激光加工、热压印或注塑成型，通常显示比PDMS更低的疏水性化合物吸附。

4.3.2 Porous-Membrane Co-Culture Barrier Models
多孔膜芯片将PC、PET、PTFE或电纺聚合物界面层压在对齐通道之间。Ahn等等离子键合PDMS层围绕7 μm PC膜（8 μm孔），将Matrigel置于膜下方。Booth和Kim使用多层PDMS/玻璃μBBB中多孔PC膜，集成TEER和渗透性测量。Sellgren等用亲水化、光学透明纳米多孔PTFE膜替换常用聚酯膜，改善光学通过性。Choi等用超薄ECM水凝胶工程化基底膜，由稀疏电纺纳米纤维支架支撑，约500 kPa界面支持iPSC衍生脑内皮细胞。膜孔密度、厚度、涂层和气泡/不完全键合均可改变输运和细胞行为。

4.3.3 Hydrogel-Micropillar Barrier Models
微柱器件利用柱间毛细管固定保留细胞负载水凝胶在灌注通道旁。Adriani等将含神经元和星形胶质细胞的胶原I凝胶限制在相邻通道，沿凝胶界面培养脑内皮细胞，创建无膜神经血管模型。Ahn等将Matrigel保留在下层通道微柱间，PC膜下方。DePalma等使用含IKVAV的HA/明胶基水凝胶在3D微流控BBB模型中，显示胶质母细胞瘤细胞改变渗透性和内皮免疫细胞粘附。天然聚合物水凝胶（如胶原I、纤维蛋白、Matrigel）提供内在细胞粘附基序和酶介导重塑，但组成和力学控制较弱；合成聚合物水凝胶（如PEG、PVA、GelMA）提供可重复组成和独立调谐的模量和网孔尺寸，但未修饰形式非粘附。

4.3.4 Three-Dimensional Tubular Barrier Models
管状系统在ECM内创建圆柱形管腔。Kim等将微针定位在3D打印框架中，在胶原I周围凝胶化后移除模板获得平行微通道，随后内皮化。Partyka等使用顺应性胶原基质中内皮化管腔，显示流动来源力学应力调节屏障渗透性和沿基质溶质输运。Wang等使用同轴挤出制造三层血管构建物，具有BBB功能，高渗甘露醇可破坏屏障随后恢复。打印改善几何可重复性和多层放置，但胶原和纤维蛋白可收缩或变形，TEER电极放置和基底侧样品回收困难。

4.3.5 Self-Assembled Vascular Barrier Models
自组装芯片将血管和血管周细胞加载到纤维蛋白或胶原隔室中，依赖血管新生和血管生成创建可灌注网络。Campisi等将人内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞嵌入纤维蛋白，获得可灌注三细胞BBB微血管网络。Bang等也使用凝血酶交联纤维蛋白形成可灌注血管网络，与星形胶质细胞直接接触。Nakayama-Kitamura等将胶原I微纤维分散在纤维蛋白中，通过整合素-β1相关机制改善星形胶质细胞存活并加速毛细血管网络形成和成熟。优势包括毛细血管尺度几何、直接多细胞接触和细胞驱动ECM重塑；缺点包括管腔直径和连通性不规则、批次依赖性可灌注网络产量、纤维蛋白压实/降解以及对TEER的有限兼容性。

4.4 BBB-Specific 3D Printing: Materials and Fabrication
3D打印是增材制造路线家族，将数字血管几何转换为刚性器件、牺牲通道模板或细胞负载水凝胶构建物。BBB相关过程类别包括挤出和同轴挤出、数字光处理（DLP）或立体光刻的槽光聚合、以及间接打印（使用可移除牺牲或支撑墨水）。可打印配方必须在沉积前、中、后满足竞争性要求。Galpayage Dona等使用DLP从PEGDA和15% GelMA制造可灌注分支支架，胶原I、含肝素Heprasil和Matrigel评估为附加细胞附着相，星形胶质细胞嵌入管腔周围，管腔接种内皮细胞和周细胞。Paone等打印PEG-降冰片烯（PEG-NB）网络并将RGD、IKVAV或HAVDI肽空间点击在通道壁或本体凝胶中，HAVDI和IKVAV衬里通道增加内皮覆盖和ZO-1，本体中RGD支持内皮-星形胶质细胞共培养。Royse等使用投影立体光刻从10 wt% GelMA、3.25 wt%低分子量PEGDA、LAP光引发剂、酒石黄光吸收剂和甘油打印可缩放可灌注BBB构建物，星形胶质细胞嵌入基质，700 μm通道随后填充周细胞和内皮细胞。挤出方面，Wang等使用胶原基低粘度复合物（增强海藻酸盐）生物打印神经血管组织，随后Wang等应用同轴沉积生成三层血管（含内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞），用于神经保护药物筛选。当前，大多数打印BBB通道仍远大于脑毛细血管，TEER难以集成在圆柱形基质中，多组分墨水使因果归因困难。

4.5 Analytical Techniques for Evaluating BBB Integrity
4.5.1 Transendothelial Electrical Resistance
跨内皮电阻（TEER）量化脑内皮单层对离子流（如Na⁺、Cl^-）的限制。Butt等报告小鼠脑脉管体内TEER高达5900 Ω·cm²。原代细胞衍生体外BBB模型产生大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）高达600 Ω·cm²，牛原代BMECs高达1800 Ω·cm²。人iPSC衍生内皮细胞产生生理TEER 4000-5000 Ω·cm²。永生化人脑内皮细胞系（如hCMEC/D3）TEER范围为50-1200 Ω·cm²。多个μBBB平台因结构设计限制（如水凝胶微柱、3D管状血管、自组装血管系统）与TEER检测不兼容。

4.5.2 Permeability Assays
小分子渗透性测试量化分子示踪剂跨屏障扩散速率，常用荧光标记葡聚糖，低分子量荧光染料如荧光素钠（376 Da）和Cascade Blue?（530 Da）也用于BBB完整性评估。

5. Material Design Principles and Preparation Technologies for In Vitro BBB Models
5.1 Biomaterial Design Principles and Comparative Analysis
五条耦合原则指导材料选择：管腔表面支持内皮粘附、极性和剪切而不吸收测试化合物；基底