综述：我们在神经系统疾病动物模型中面临的转录组学挑战

《Current Issues in Molecular Biology》：Transcriptomic Challenges We Faced with Animal Models for Neurological Disorders

　　

在动物模型上模拟人类神经系统疾病具有优势：它允许控制和操纵大多数调节因素，并产生真实的生物学复制品；而除了若干共同特征之外，每个人类都是动态且独特的。此外，研究人员可以在获得将其应用于人类的许可之前，先在动物身上探索新的治疗策略。然而，实验结果取决于物种、品系、性别、年龄、激素状态、饮食、低氧暴露、毒素、辐射、外部刺激、应激和饲养条件。进一步的复杂性来源于组织异质性、技术限制、计算复杂性以及将实验结果整合为连贯生物学图景的困难。此外，大多数疾病是多因素的，与若干基因的结构改变和/或表达改变相关。基因工程动物的一个主要问题是，除靶基因外，由于功能通路中的相互关联，众多其他基因也会发生突变和/或被调控。本基于经验的方法学评述提出了研究人员在解读与若干神经系统疾病相关的转录组改变时所使用的小鼠、大鼠和兔模型的挑战、相关性和局限性。文中提供了可公开访问的数据库链接，其中包含实验方案和表达谱，供有兴趣重新分析本研究数据并将其与其他研究结果进行比较的读者使用。

**1. 引言**
人类神经系统疾病除常见症状外，还受种族、性别、年龄、地理、气候及吸烟、饮酒、饮食、应激、毒素等动态组合因素影响，即使单卵双胞胎对同一疾病的反应也不同。人体研究受伦理和制度限制，仅能利用手术组织、血液和影像等手段，死后脑组织也仅代表有限病理谱。因此，动物模型成为必要选择，尽管无法完全复制人类疾病，但可在受控条件下研究分子机制、探索治疗方案。本文基于长期经验，总结小鼠、大鼠和兔模型中模拟星形细胞瘤、癫痫、青光眼、脑型疟、多发性硬化、神经母细胞瘤、神经精神性红斑狼疮、眼齿指发育不良和X连锁夏科–马里–图思病等疾病时面临的转录组学挑战。
**2. 动物模型的主要决定因素**
动物模型的分子特征受物种、品系、性别、年龄/发育阶段、组织与区域、模型构建方式影响，并受饮食、缺氧、毒素、辐射、外源刺激、激素状态、病史、治疗乃至微重力调节。研究还表明，神经元状态与动作电位模式密切相关，某些蛋白的亚细胞定位在性别间有差异且随雌激素周期变化，因此雌性模型更难处理。饲养条件、麻醉方式也会影响神经转录组。即使所有条件一致，仍存在生物学随机变异，同一肿瘤内部不同结节转录组也不同。细胞环境对基因表达影响显著，共培养的星形胶质细胞和少突胶质细胞相互调控大量功能通路。永生化细胞系虽稳定，但生理状态与原发性细胞差异显著，培养纯度与细胞周期同步化对结果解释至关重要。
**3. 基因工程动物模型**
**3.1 一般考虑**
多数疾病是多基因、多因素的，仅改变一个生物标志物基因往往不足以模拟疾病。研究提出基因组结构范式，强调基因表达水平、表达控制和基因间表达相关性的全面分析。基因工程动物除靶基因外，还会因功能通路连锁而调控数百个其他基因，且不同个体、不同组织区域、不同时间点的受影响基因组合均不相同。
**3.2 眼齿指发育不良**
ODDD被认为由GJA1基因突变引起，该基因编码星形胶质细胞中重要的缝隙连接蛋白Cx43。研究使用Gja1敲除、条件性敲除和siRNA敲低小鼠，发现转录组改变强烈依赖小鼠品系。完全敲除小鼠因心脏发育异常出生时死亡，因此需在围产期取样。
**3.3 X连锁夏科–马里–图思病**
CMT1X由X染色体上GJB1基因功能缺失突变导致，该基因编码少突胶质细胞和施万细胞中的Cx32。由于男性仅有一条X染色体，男性患者更常见且更严重。比较Gjb1敲除和野生型小鼠脑转录组发现，除Gjb1外数百个基因显著改变，且Gja1和Gjb1敲除脑的调控网络存在显著重叠，提示全胶质转录组连续性。
**3.4 颞叶癫痫**
TLE模型常用匹罗卡品、海人酸等化学致痫剂，或电点燃、创伤、基因操作等。研究Gjd2（编码神经元缝隙连接蛋白Cx36）敲除小鼠发现，除Gjd2外大量基因表达改变，且其脑调控网络与胶质基因敲除模型差异很大，提示神经元与胶质细胞转录组相互作用有限。
**3.5 青少年肌阵挛癫痫**
JME是多基因疾病，涉及EFHC1、KCNC1、BRD2、CSTB等基因。Brd2单倍剂量不足小鼠模型表现出GABA能神经元缺陷和性别依赖性行为特征，转录组研究揭示了神经传递基因网络存在性别差异。
**3.6 神经精神性红斑狼疮**
NPSLE模型包括MRL/lpr小鼠等。研究在动情周期同期处死的MRL/lpr-Fn14敲除雌性小鼠脑皮质和海马中发现趋化因子及PI3K/AKT信号通路显著改变，并揭示神经炎症与神经退行性变的联系。
**4. 神经系统疾病的诱导动物模型**
**4.1 一般考虑**
化学、激素、寄生虫和机械诱导方法可模拟疾病症状，但诱导物很少是真实患者的病因。
**4.2 多发性硬化**
AT-EAE小鼠模型通过注射髓鞘碱性蛋白诱导。研究显示脊髓中Gja1下调，伴随营养不良神经元和单核细胞增加，Ca²⁺信号、细胞周期、细胞骨架、能量代谢、RNA加工及离子和小分子转运等功能通路的表达控制和协调均改变。
**4.3 青光眼**
大鼠视神经挤压模型导致视网膜神经节细胞减少约60%，补体级联和Notch信号通路相关基因的表达水平、控制和网络显著改变。
**4.4 周期性癫痫**
去卵巢大鼠给予海人酸诱导癫痫持续状态，并用17β-雌二醇苯甲酸酯处理，比较海马齿状回转录组，量化雌激素对神经传递的保护作用。
**4.5 婴儿痉挛症**
采用“两次打击”模型：产前给予倍他米松，出生后给予NMDA触发痉挛。研究发现性别二态性明显，雄性突触传递转录组改变更多，但抗炎治疗恢复更有效；室旁核与弓状核的转录组效应显著不同，表明脑区敏感性差异。
**4.6 生发基质出血–脑室内出血**
早产兔注射甘油诱导IVH，用于评估PPAR-γ对髓鞘形成的促进作用及17β-雌二醇对海马齿状回发育的恢复效应，雌激素可增加钙结合蛋白中间神经元和prox1神经元数量。
**4.7 脑性瘫痪**
早产兔出生后给予地塞米松和倍他米松，诱导髓鞘形成不足、胶质增生和神经功能缺损。
**4.8 脑型疟**
伯氏疟原虫ANKA感染小鼠模型显示染色质重塑、细胞发育、凋亡负调控、脂质代谢、水解酶活性、行走及肌肉收缩调节相关基因显著改变，但该研究以全脑为样本，未考虑区域差异。
**5. 实验问题**
**5.1 技术噪声**
从样本采集到结果输出，任何分子检测都受分辨率、饱和度和技术噪声影响。RNA测序、微阵列和qRT-PCR均存在噪声来源；研究发现微阵列和测序平台在遵循厂商方案时存在25%–35%技术噪声，qRT-PCR也存在约12%噪声。荧光染料选择也会影响结果，研究采用“多重黄色”策略，将生物重复样本互相杂交，避免两种染料偏差，并将技术噪声降至15%–20%。
**5.2 分析问题**
传统分析仅关注平均表达水平，丢失大量信息。研究提出基因组结构范式，用平均表达水平、相对表达变异和表达相关性三个独立指标全面表征转录组。表达控制可反映细胞维持转录稳态的能力，表达相关可构建实际条件下的基因调控网络。与文本挖掘得到的固定通路不同，相关性网络随疾病或治疗发生重塑。研究还采用灵活表达的差异倍数阈值，以减少假阳性和假阴性。
**6. 最佳实践建议**
动物选择应尽量接近人类，优先使用同窝、同性别动物，选择能更好模拟人类疾病进程的品系。应重视饲养条件，减少应激；处死方式中，断头对神经系统影响较小。样本采集应快速冻存，雌性动物应在同一动情周期阶段取样。平台选择取决于目标与成本，建议每个条件至少4个生物学重复。分析时应纳入表达控制与表达相关等指标，并谨慎使用WGCNA；数据需按MIAME标准提交至公共数据库。
**7. 讨论**
动物模型只能部分模拟人类疾病的复杂病因，大多数神经系统疾病是多因素的，但即使是单基因或少数基因改变的模型仍有助于理解基本机制。新兴技术如单细胞测序、空间转录组学、神经芯片等更适合复杂神经系统研究，但仍需技术重复验证。
**8. 结论**
动物模型的主要优势是能够控制大多数调节因素并在生物学重复中探索治疗策略；而人类个体即使单卵双胞胎也各不相同，新疗法引入需复杂审批过程。