母体邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)暴露以性别特异性方式改变后代肠道微生物群和结肠转录组

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Maternal di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) exposure alters offspring gut microbiota and the colonic transcriptome in a sex-specific manner

　　

母体在妊娠和哺乳期暴露于塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)会编程后代肠道健康产生持久的性别特异性改变。本研究使用C57BL/6小鼠模型，探讨了围产期DEHP暴露对后代肠道健康的跨代影响。研究人员在妊娠和哺乳期通过饮食对母鼠给予0、40或400?ppm的DEHP。研究人员分析了后代的生长表型、肠道组织学、肠道微生物群和结肠转录组学。研究人员发现，围产期DEHP暴露不影响母鼠或后代的生长，但诱导了显著的肠道结构损伤。在雄性和雌性后代中，这种损伤表现为结肠长度缩短和结肠杯状细胞数量减少。这种共同的损伤引发了强烈分化的下游反应。结肠转录组学揭示，雌性后代表现出强大的防御反应，其特征是异源物质代谢途径显著上调（例如细胞色素P450基因Cyp3a44和Cyp3a25的表达）。相反，雄性后代表现出微弱的转录反应，偏向于免疫调节。肠道微生物群以性别依赖方式被重塑：雄性后代表现出微生物多样性增加和拟杆菌属(Bacteroides)物种减少，而雌性后代则表现出黏蛋白降解的阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)富集。整合功能分析预测，雄性偏向宿主-微生物能量代谢，雌性偏向脂质和解毒途径。这些发现表明，母体DEHP暴露损害肠道屏障完整性，并建立性别二态的微生物群-宿主代谢轴，为环境内分泌干扰物长期疾病易感性的发育编程提供了新机制。

**论文解读：母体DEHP暴露以性别特异性方式编程后代肠道健康——基于多组学整合的机制研究**

**研究背景与问题**
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是全球产量最大的邻苯二甲酸酯塑化剂，广泛存在于食品包装、医疗器械、儿童玩具和日用品中。DEHP作为一种环境内分泌干扰物，具有生殖发育毒性、神经毒性和免疫毒性。由于其非共价结合于塑料基质，DEHP易迁移至环境介质和食物链，并通过消化道、呼吸道和皮肤进入人体。特别值得注意的是，DEHP及其代谢物可在孕妇和哺乳期妇女的血液、尿液、脐带血和母乳中检出，表明其能直接影响发育中的胎儿和新生儿，成为不容忽视的公共健康问题。

围产期（从妊娠到哺乳结束）是后代早期编程的关键窗口。在此期间，后代的肠道及其相关微生物群经历高度敏感和动态的成熟过程。肠道微生物群从初始定植到建立稳定生态系统，与宿主的免疫、代谢和神经系统发生复杂相互作用。然而，目前对DEHP诱导的微生物群变化与后续健康效应之间因果关系的理解有限。大多数研究仅描述DEHP暴露后微生物群组成的变化，而未阐明这些变化如何转化为生理或病理效应。此外，现有研究模型较为单一，大多聚焦生殖毒性，对肠道微生态关注不足，且缺乏对性别差异的系统性探讨。因此，研究围产期DEHP暴露如何干扰肠道稳态，对于理解过敏、代谢性疾病等发育性疾病的起源具有重要意义。

**研究概述**
本研究采用C57BL/6小鼠模型，在妊娠和哺乳期通过饮食对母鼠(F0)给予0(对照)、40 ppm或400 ppm的DEHP，使子代(F1)在宫内和哺乳期均暴露于DEHP。子代小鼠在10周龄时被处死，通过整合结肠转录组学、16S rRNA基因测序和组织病理学分析，系统表征母体DEHP暴露后宿主与微生物群的相互作用。研究旨在阐明母体DEHP暴露通过破坏后代肠道微生物群和物理/黏膜屏障影响长期健康的因果关系及分子机制。

**主要技术方法**
1. **16S rRNA基因测序**：从结肠内容物提取DNA，对16S rRNA基因V4高变区进行测序（Illumina NovaSeq 6000平台），使用QIIME2(ver. 2020.6)处理，Deblur去噪并聚类为扩增子序列变体(ASV)，基于SILVA 99% rRNA基因参考数据库(ver. 138)进行物种分类。
2. **结肠转录组测序**：使用TRIzol提取总RNA，富集mRNA后构建文库，在Illumina NovaSeq? 6000平台进行双端150 bp测序(PE150)。数据经HISAT2比对参考基因组、StringTie组装并计算FPKM值，DESeq2/edgeR进行差异表达基因分析，GO和KEGG通路富集分析。
3. **组织病理学分析**：结肠组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片后，进行阿尔新蓝-过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色，量化黏液层厚度和AB-PAS阳性细胞（杯状细胞）数量。小肠组织采用苏木精-伊红(HE)染色，测量绒毛长度、隐窝深度及比值。
4. **统计方法**：数据以均值±标准误(SEM)表示，使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 10分析。正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析(ANOVA)及Tukey事后检验；不满足正态性假设的数据（如部分微生物α多样性指数）采用非参数Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验（Bonferroni校正）。

**研究结果**

**3.1 母体DEHP影响后代生长表型**
通过体重监测和器官称重发现，母体DEHP暴露未显著改变F0代母鼠或F1代后代的体重增长轨迹。但器官重量分析显示性别特异性效应：400 ppm DEHP显著增加雌性后代心脏重量；400 ppm DEHP显著增加雄性后代肝脏重量及肝脏/体重比；40 ppm DEHP显著增加雄性后代相对脾脏重量。表明母体DEHP暴露对后代长期影响存在明显的性别二态性。

**3.2 母体DEHP破坏母鼠和后代肠道形态**
组织形态学分析显示，母体DEHP暴露以剂量依赖方式改变母鼠结肠结构：400 ppm组黏膜层厚度显著降低，结肠隐窝中杯状细胞数量显著增加，结肠长度显著增加。在F1代后代中，DEHP暴露组结肠长度显著缩短，杯状细胞数量显著减少，但黏膜层厚度未受影响。小肠分析显示，400 ppm DEHP导致后代绒毛长度和隐窝深度显著缩短，绒毛长度/隐窝深度比值增加。表明母体DEHP暴露编程了后代肠道结构的长期改变。

**3.3 母体DEHP改变母鼠和后代结肠转录组**
RNA测序揭示，母体DEHP暴露诱导显著的转录变化，且模式在母鼠(F0)与后代(F1)以及性别间存在差异。母鼠DEHP-400组鉴定出325个差异表达基因(DEG)(125个上调，200个下调)。雌性后代DEHP-400组有221个DEG(65个上调，156个下调)，而雄性后代仅16个显著DEG(12个上调，4个下调)，表明强烈的性别特异性易感性。Venn图显示各组间DEG重叠极小，提示转录反应在很大程度上是各自独特的。

**3.4 母体DEHP暴露以性别和世代特异性方式改变结肠功能富集**
GO富集分析显示，母鼠和雌性后代中显著富集的生物学过程(BP)包括“对异源物质刺激的反应”、“类固醇代谢过程”等，雄性后代则富集“免疫球蛋白产生”和“免疫反应分子介质的产生”。KEGG通路分析进一步支持：母鼠富集“类固醇激素生物合成”、“化学致癌-DNA加合物”等；雌性后代富集“亚油酸代谢”、“胆汁分泌”等；雄性后代富集“细胞因子-细胞因子受体相互作用”。Reactome通路分析发现后代中“ERBB2信号下调”显著改变，提示对生长因子信号和肠上皮稳态的潜在影响。

**3.5 母体DEHP重塑母鼠和后代肠道微生物群组成**
16S rRNA测序显示，母鼠DEHP-400组Chao1指数显著降低（α多样性下降），β多样性分析(PCoA)显示微生物群落结构显著分离。在门水平，DEHP暴露导致拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度降低，厚壁菌门(Firmicutes)升高，Firmicutes/Bacteroidota比值增加。LEfSe分析揭示促炎菌属（如埃希氏菌-志贺菌属、肠杆菌属、嗜胆菌属）增加，有益菌属（如Lachnospiraceae NK4A136群、丁酸球菌属、副萨特氏菌属）减少。
在F1后代中，微生物群变化呈性别特异性。雄性后代α多样性(Chao1和Shannon指数)在DEHP-40组显著增加，β多样性显著分离；LEfSe分析显示多种拟杆菌属（如B. thetaiotaomicron、B. vulgatus、B. uniformis）丰度下降。雌性后代α多样性无显著变化，但DEHP-400组富集了黏蛋白降解的阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)、伯克霍尔德菌目细菌和Lachnospiraceae细菌，同时副拟杆菌属(Parabacteroides gordonii)耗竭。

**3.6 整合分析揭示性别特异性宿主-微生物代谢轴**
微生物功能预测与宿主转录组整合分析显示，雄性后代中宿主和微生物变化共同富集能量代谢途径（如柠檬酸循环、脂肪酸代谢、支链氨基酸降解）及细菌运动相关途径（ABC转运蛋白、细菌趋化性、鞭毛组装）。雌性后代则富集脂质、胆汁酸和抗氧化代谢途径（如类固醇生物合成、初级和次级胆汁酸生物合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、谷胱甘肽代谢）。此外，在暴露母鼠和雄性后代中共同鉴定出脂肪酸生物合成和胰岛素信号通路等核心途径，提示雄性特异的跨代谢遗传。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究创新性地将结肠转录组学与16S rRNA基因测序结合，在围产期DEHP暴露小鼠模型中系统揭示了宿主-微生物群的性别二态性相互作用。主要发现包括：母体DEHP暴露导致后代共同的肠道屏障损伤（结肠缩短、杯状细胞减少），但引发性别分化的下游反应——雌性后代通过上调异源物质代谢（如Cyp3a44、Cyp3a25）和富集Akkermansia muciniphila实现解毒抵抗，而雄性后代转录反应微弱且偏向免疫调节，并伴随微生物多样性增加和拟杆菌属减少。整合分析预测雄性偏向能量代谢，雌性偏向脂质/解毒途径。ERBB2信号下调可能是屏障缺陷的共同分子机制。这些结果将肠道及其微生物群定位为DEHP发育毒性的关键靶点和介质，为“健康与疾病发育起源”(DOHaD)理论提供了新机制框架。

**研究结论**：总之，本研究证明，母体在围产期暴露于DEHP通过多层面机制编程了后代肠道健康的持久性别特异性改变，该机制涉及肠道屏障完整性受损、分化的失调微生物群重塑以及结肠黏膜的差异转录重编程。共同的屏障缺陷——表现为结肠长度缩短和杯状细胞减少——在两种性别中建立了共同的易感性。然而，随后的适应性反应深刻分化：雌性后代建立以异源物质代谢为中心的强大转录防御，可能由Akkermansia富集的微生物群支持；而雄性后代表现出微弱的转录反应，偏向免疫调节，并伴随重塑但更多样化的微生物群落。这些性别二态的宿主-微生物代谢轴——雄性偏向能量代谢，雌性偏向脂质/解毒途径——可能解释后期对代谢性和炎症性疾病的不同易感性。研究结果将肠道及其驻留微生物群定位为DEHP发育毒性的关键靶点和介质，为DOHaD范式提供了新机制框架。靶向这一性别特异性宿主-微生物轴可能为减轻环境诱导疾病的发育起源提供新策略。