杀菌剂在体外人体模型中增强炎症反应并损害胃肠道屏障完整性

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Fungicides enhance inflammatory response and hamper gastrointestinal barrier integrity in in vitro human models

　　

真菌感染对农业生产构成重大挑战，促使广泛使用杀菌剂以防止作物损失。尽管这些化合物有效控制真菌病原体，但越来越多的证据表明它们也可能对人类健康产生非预期影响。事实上，它们对人类免疫细胞和肠上皮功能的影响仍未得到充分表征。在本研究中，研究人员使用人体体外模型，研究了四种广泛使用的农业杀菌剂（嘧菌酯(azoxystrobin)、氟吡菌酰胺(fluxapyroxad)、氰霜唑(cyazofamid)和环氟菌胺(cyflufenamid)）对炎症反应、巨噬细胞代谢和上皮屏障完整性的影响。将PBMC（外周血单核细胞）来源的巨噬细胞暴露于浓度为1至50 μM的杀菌剂中，以评估炎症和代谢反应，同时使用Caco-2细胞评估上皮屏障功能。所有测试的杀菌剂均未诱导显著毒性。然而，这四种化合物均增强了促炎标志物CXCL10、TNF和CD80的表达，并增加了总NF-κB p65蛋白水平。此外，氰霜唑(cyazofamid)促进了从抗炎M2样状态向促炎表型的转变，并诱导了GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）处理的非极化巨噬细胞向M1样极化。基于NMR（核磁共振）的代谢组学分析揭示了深刻的代谢重编程，其特征为糖酵解代谢增强、琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase, SDH)抑制促进的琥珀酸释放增加以及细胞外氨基酸水平降低。此外，所有杀菌剂均通过降低跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)、增加细胞旁通透性和改变occludin定位来损害上皮屏障功能。总体而言，这些发现表明，具有不同化学结构和作用机制的农业杀菌剂汇聚于共同的促炎和代谢途径，促进巨噬细胞活化和肠道屏障功能障碍。这些结果为杀菌剂暴露的促炎效应提供了新的机制性见解，并强调了需要进一步研究以评估其对人类健康的潜在影响。

### 论文解读：杀菌剂通过代谢重编程与肠道屏障破坏协同促进炎症反应

#### 研究背景与目的
真菌病原体对作物生产构成持续且经济破坏性巨大的威胁，迫使农业依赖化学控制策略。杀菌剂的广泛使用虽有效抑制真菌，但其残留物在土壤、水体和食物基质中频繁检出（浓度范围0.01–30 μg/L），引发对生态与人类健康潜在不良效应的担忧。既往研究显示，部分杀菌剂可刺激体外和体内模型中的促炎细胞因子产生，但常见农业杀菌剂对人体巨噬细胞极化、免疫代谢及肠上皮屏障功能的直接作用尚未明确。鉴于膳食摄入是人体暴露于杀菌剂残留的主要途径，阐明其对免疫与肠道屏障的双重影响至关重要。该研究针对四种广泛应用且代表不同化学类别与作用机制的杀菌剂——嘧菌酯（azoxystrobin，甲氧基丙烯酸酯类）、氟吡菌酰胺（fluxapyroxad，琥珀酸脱氢酶抑制剂SDHI类）、氰霜唑（cyazofamid，氰基咪唑类）和环氟菌胺（cyflufenamid，肟醚类），采用人体体外模型系统评估其对炎症反应、巨噬细胞代谢及肠上皮屏障完整性的影响。研究结果发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

#### 主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术：1）从3名健康女性献血者的外周血单个核细胞（PBMC）中分离CD14⁺单核细胞，经GM-CSF或M-CSF诱导分化为巨噬细胞，并暴露于杀菌剂（1–50 μM）后，用LPS+IFNγ或IL-10进行极化刺激；2）利用Caco-2细胞系构建肠上皮屏障模型，评估跨上皮电阻（TEER）、FITC-葡聚糖细胞旁通透性及occludin免疫荧光定位；3）通过qRT-PCR检测M1/M2标志物（CXCL10、TNF、CD80、CD163）mRNA表达，Western blot分析NF-κB p65蛋白水平；4）采用Seahorse XFe96实时分析细胞外酸化率（ECAR）评估糖酵解功能；5）通过分光光度法测定粗线粒体组分中琥珀酸脱氢酶（SDH）活性；6）利用NMR（核磁共振）代谢组学分析细胞内外代谢物谱。

#### 研究结果
**3.1 杀菌剂通过上调M1样巨噬细胞标志物增强炎症反应**
所有四种杀菌剂在1–50 μM浓度下均不显著影响M1样巨噬细胞（LPS+IFNγ刺激）的活力，但浓度依赖性地提高CXCL10、TNF和CD80的mRNA表达水平。Western blot显示，50 μM处理组的总NF-κB p65蛋白水平显著高于未处理对照组，提示NF-κB信号通路可能参与响应。此外，仅有氰霜唑（cyazofamid）在IL-10极化的M2样巨噬细胞中降低CD163表达并升高TNF，表明其可促使M2向M1表型转化；在GM-CSF分化的非极化巨噬细胞中，氰霜唑单独处理即可上调CXCL10、TNF和CD80，说明该化合物本身足以诱导促炎极化。

**3.2 杀菌剂促进M1样巨噬细胞的糖酵解代谢**
NMR代谢组学分析发现，与未处理M1样巨噬细胞相比，嘧菌酯、氰霜唑和氟吡菌酰胺处理的细胞外培养液中α-葡萄糖水平降低，乳酸水平在氟吡菌酰胺组增加，且所有处理组均出现琥珀酸释放增加、谷氨酰胺及多种氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸）水平降低。主成分分析（PCA）显示处理组与对照组代谢指纹分离。Seahorse功能分析证实，三种杀菌剂显著增强糖酵解和糖酵解容量。同时，SDH活性测定显示，所有处理组线粒体SDH活性显著降低，与琥珀酸积累一致。这些变化共同表明杀菌剂驱动了以增强糖酵解、抑制SDH导致琥珀酸外排、减少细胞外氨基酸为特征的代谢重编程，支持M1样促炎表型。

**3.3 杀菌剂诱导Caco-2细胞上皮屏障损伤**
所有四种杀菌剂在0.5–50 μM处理24 h后不显著降低Caco-2细胞活力，但在50 μM浓度下（环氟菌胺和氟吡菌酰胺在更低浓度也有作用）显著降低TEER值，并增加FITC-葡聚糖的细胞旁通透性。免疫荧光显示，50 μM处理后occludin蛋白在细胞连接处的定位变得不连续且紊乱，表明紧密连接完整性受损。这些效应在所有化合物中一致，说明肠道屏障破坏是共同特征。

#### 讨论与结论
讨论部分指出，尽管四种杀菌剂化学结构和作用机制不同（如嘧菌酯和氰霜唑抑制线粒体复合体III，氟吡菌酰胺直接抑制SDH），但均通过NF-κB信号上调促炎标志物，并诱导M1样代谢重编程，包括增强糖酵解、抑制SDH活性导致琥珀酸积累与释放。琥珀酸作为促炎免疫代谢物，可能进一步放大炎症信号。此外，肠道屏障破坏可能促使免疫细胞浸润并维持局部炎症。研究局限性包括急性暴露条件、体外模型无法完全模拟体内复杂相互作用（如宿主-微生物群-外源物互作）及缺乏毒代动力学数据。研究结论翻译如下：
**结论**：本研究发现，化学和机制上截然不同的杀菌剂环氟菌胺、嘧菌酯、氰霜唑和氟吡菌酰胺主动促进人巨噬细胞的促炎程序，表现为促炎基因和总NF-κB p65蛋白水平上调、糖酵解代谢增强、以及琥珀酸脱氢酶抑制相关的细胞外琥珀酸释放增加。这些改变共同指向M1样表型转化，表明这些化合物直接调节巨噬细胞极化和免疫代谢状态。值得注意的是，所有测试杀菌剂均损害肠上皮完整性，提示对免疫和屏障功能的双重破坏可能助长肠道炎症。鉴于人类对杀菌剂的广泛和反复暴露，该发现引发了对其在慢性炎症及其他免疫介导疾病中潜在贡献的重要关切。未来研究应确定杀菌剂在巨噬细胞代谢通路中的分子靶点，并在长期和体内模型中验证这些效应，以更好定义其与人类健康的相关性。