假单胞菌CMR5c T22（*Pseudomonas* sp.）在生物炭辅助下对2,4,6-三硝基甲苯的生物转化：协同机制与代谢重编程

《Environmental Research》：Biochar-assisted biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. CMR5c T22: synergistic mechanisms and metabolic reprogramming

　　**摘要**2,4,6-三硝基甲苯（TNT）因其高毒性、致癌性及环境持久性，对生态安全和人类健康构成严重威胁。尽管微生物生物修复具有环保和经济优势，但其效率常因在TNT胁迫下去除率低和微生物耐受性弱而受限。本研究利用生物炭促进微生物对TNT的生物转化，并系统阐明了其协同机制。共筛选四种来源于不同废弃物的生物炭，其中木质生物炭（MBC）表现出最佳性能。添加MBC后，在初始TNT浓度为100 mg/L的条件下，48小时内TNT去除率由46.2%（仅菌株对照）提升至88.7%。同时，一级动力学速率常数由0.01323 h?1（仅菌株）升高至0.03987 h?1，表明MBC显著加速了TNT的去除速率。生物炭通过降低水体中TNT浓度，加速了去除动力学，缓解了TNT对菌株T22生长的抑制作用，并刺激胞外聚合物（EPS）分泌。非靶向代谢组学显示，生物炭-微生物系统中存在330个上调的差异代谢物，表明代谢发生了显著重编程。机制上，MBC通过激活硝基甲苯降解途径和辅因子生物合成途径直接增强TNT转化。所提出的协同机制包括：(1)削弱TNT暴露；(2)增强抗氧化代谢；(3)激活核心转化途径；(4)补充基础代谢供给。尽管完全矿化及土壤尺度验证不在本研究范围内，但本研究为设计用于增强硝基芳香污染物修复的生物炭-微生物系统奠定了机制基础。**引言**军事和民用活动导致环境中硝基芳香类爆炸物残留污染严重，特别是2,4,6-三硝基甲苯（TNT），它是最广泛使用的炸药之一。由于对称的硝基官能团，TNT在环境中较为稳定，导致地表水、地下土壤和地下水大范围污染。研究表明，TNT及其衍生物毒性高、致突变性强，且在环境中持久存在，通过吸入和皮肤接触可引起多种健康问题，包括贫血、白内障、神经功能缺陷、肝脏疾病及多种癌症。此外，TNT还对动植物构成严重威胁。美国环境保护署（EPA）已将TNT列为C类致癌物，TNT被公认为最严重的环境污染物之一。鉴于接触爆炸类化学物质造成的不可逆影响，迫切需要有效措施防止其污染。近年来，TNT污染废水的处理成为重要研究方向。已实施多种处理方法——物理法、化学法和生物法。然而，这些方法可能繁琐、效率低，并导致二次污染。由于具有成本低、环境友好及降解效率高优势，生物修复越来越被视为应对爆炸物污染的有前景技术。假单胞菌、芽孢杆菌和克雷伯菌等微生物表现出降解TNT的潜力。然而，游离微生物在实际应用中面临挑战，包括降解效率低、对环境条件敏感以及难以在极端环境中存活。例如，从爆炸污染土壤中分离的氯酚杆菌S5-TSA-26菌株对120 mg/L TNT的生物转化需要15天培养，原因是菌株活性低。TNT废水对假单胞菌、大肠杆菌和假交替单胞菌等多种微生物具有急性毒性，在浓度高于30 mg/L时会显著改变其形态结构。TNT污染造成的不利条件阻碍微生物活性，使其难以达到预期降解水平。生物炭是在限氧条件下热解农业废弃物生物质得到的富碳材料，具有丰富的表面官能团、多孔结构和大的比表面积。这些特性使生物炭能够吸附污染物，降低其对微生物的毒性，增强生物相容性，并为微生物生长提供栖息地。多项研究表明，生物炭可作为生物刺激剂，影响有机污染物的生物降解，受到研究人员广泛关注。由于生物炭具有致密的孔隙结构和大的比表面积，它可作为微生物载体，调节细菌生存微环境，促进有机污染物降解。此外，生物炭可刺激胞外聚合物（EPS）分泌，而EPS是细菌细胞膜的关键组成部分，可能与生物炭相互作用影响TNT生物降解。尽管取得了这些进展，但对生物炭如何同时作为吸附剂、微生物载体和代谢调节剂发挥作用的系统理解仍然缺乏。以往关于TNT生物修复的研究大多采用三种彼此独立的方法，每种方法都有其固有局限：(i) 筛选游离菌株的TNT转化效率，而未考察细胞生理响应；(ii) 仅将生物炭作为吸附剂用于封存TNT，忽略了微生物协同作用；(iii) 在土壤基质中应用生物炭，但仅报告总体去除率，而未区分吸附和生物转化，也未阐明分子机制。因此，连接生物炭与细菌生理及代谢响应的整合机制在TNT生物修复中尚未阐明。在此背景下，本研究考察了四种生物炭（MBC、YBC、WBC、NBC，分别来源于木材、椰壳、污泥和牛骨）对TNT去除的促进作用，所用的菌株为假单胞菌CMR5c T22，该菌株分离自山西省侯马市TNT污染土壤，在实验室水系统中对0.1%（w/v）TNT补充表现出显著的耐受性。系统分析了转化效率、细菌生长、EPS产生和代谢响应。通过动力学分析、显微表征和代谢组学剖析揭示了生物炭与菌株T22之间的协同机制。本工作旨在为生物炭辅助生物修复在TNT污染环境中的应用提供科学依据和技术支持。**章节摘要****化学试剂与材料**所使用的生物炭（MBC、YBC、WBC、NBC）制备过程见我们之前的研究，所有四种生物炭的表征参数如表S1所示。TNT取自废旧炸药，在通风良好的通风橱内用丙酮溶解，并使用防爆照明。储备液的TNT浓度采用液相色谱法校准。本研究所用其他化学品均为分析纯，购自Sigma-Aldrich。**生物炭对T22去除TNT的影响**评估了菌株T22在48小时内对TNT的去除性能。如图1A所示，添加MBC导致前14小时内TNT快速去除，效率为56.5%。相比之下，YBC、WBC和NBC添加体系中的TNT去除效率明显较低，分别为31.9%、27.0%和27.6%。培养48小时后，MBC、YBC、WBC和NBC组中的TNT去除效率分别达到88.5%、78.3%、57.1%和56.1%。**结论**总之，本研究证明生物炭，尤其是MBC，通过吸附、载体保护和代谢重编程的多机制协同作用，显著增强了假单胞菌CMR5c T22对TNT的转化。48小时去除率由46.2%提升至88.7%，准一级速率常数提高了3倍。代谢组学揭示生物炭激活了硝基甲苯降解和辅因子生物合成，并增强了抗氧化和……**CRediT作者贡献声明****Bin Dong**：审阅与编辑、初稿撰写、资源获取、资金获取、概念构思。**Yongbing Zhu**：审阅与编辑、指导、项目管理。**Songhao Luo**：数据整理。**Sanping Zhao**：审阅与编辑、形式分析、概念构思。**Mengwei Han**：初稿撰写、方法论、数据整理。**Chengxu Lai**：方法论、数据整理**未引用文献**EPA U.S., 2014.**利益冲突声明**作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。**致谢**本研究由国家自然科学基金（22106182）和国家重点研发计划（2022YFC3702500）资助。Bin Dong | Chengxu Lai | Mengwei Han | Sanping Zhao | Songhao Luo | Yongbing Zhu北京102205，中国有害化学物防护化学重点实验室