《Fish & Shellfish Immunology》：Role of giant grouper (
Epinephelus lanceolatus) protein kinase R in antiviral responses and the regulation of eIF2α phosphorylation during nervous necrosis virus infection
编辑推荐：
•巨型石斑鱼蛋白激酶R可以抑制神经坏死病毒（NNV）的复制。•ggPKR与病毒双链RNA（dsRNA）的相互作用。•ggPKR介导的eIF2α磷酸化能够抑制细胞内的病毒复制。引言病毒性疾病，包括由虹彩病毒（Iridovirus）和贝塔诺病毒（Betanodavirus）等病毒引起
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巨型石斑鱼蛋白激酶R可以抑制神经坏死病毒（NNV）的复制。
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ggPKR与病毒双链RNA（dsRNA）的相互作用。
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ggPKR介导的eIF2α磷酸化能够抑制细胞内的病毒复制。
引言
病毒性疾病，包括由虹彩病毒（Iridovirus）和贝塔诺病毒（Betanodavirus）等病毒引起的疾病，对全球水产养殖业构成了重大威胁[1]。这些疾病在水生环境中迅速传播，导致巨大的经济损失和水产养殖产量下降。最近关于病毒性疾病的研究发现，干扰素（IFN）通路是一条关键的抗病毒信号传导通路[2]。研究表明，干扰素通路在抵抗橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）中神经坏死病毒（NNV）感染的过程中发挥着重要作用，橙斑石斑鱼是亚洲重要的水产养殖物种[2] [3]。干扰素通路会诱导多种抗病毒蛋白的表达，包括Mx蛋白和蛋白激酶R（PKR）通路，这些蛋白是宿主防御机制的关键组成部分[4] [5] [6] [7] [8]。Mx1基因是干扰素通路的下游效应分子，在哺乳动物和其他物种中都进行了研究，其在橙斑石斑鱼神经系统中的抗病毒特性也得到了证实[4]。Mx1特异性地与NNV的衣壳蛋白相互作用，直接抑制病毒复制，从而发挥抗病毒作用[5]。
在哺乳动物中的研究表明，类似于Mx通路的PKR通路在抗病毒反应中也起着关键作用。PKR与病毒双链RNA（dsRNA）结合，在激活后会磷酸化真核生物的翻译起始因子2α（eIF2α），从而抑制蛋白质的翻译[9] [10]。在哺乳动物细胞中，PKR广泛分布[9]，其基因表达由ISGF3蛋白复合物上调，该复合物由STAT1（信号转导和转录激活因子1）、STAT2和IRF9（干扰素调节因子9）组成，它们结合在细胞核中的转录因子结合位点[11]。除了抑制蛋白质翻译外，PKR还参与免疫基因调控和免疫反应，包括细胞凋亡和焦亡[12] [13]。作为进化上保守的蛋白域，PKR不仅存在于哺乳动物中，也存在于变温动物和软体动物中[14]。与哺乳动物不同，鱼类是变温动物且进化历史悠久，其体温受环境影响显著，它们的免疫系统与哺乳动物也有很大差异[15]。环境温度也会影响鱼类的干扰素反应，可能影响病毒感染期间的抗病毒活性和免疫系统的调节功能[15] [16] [17]。PKR在多种鱼类中的抗病毒作用已被证实，包括条纹喙鱼（Oplegnathus fasciatus）和河豚（Takifugu rubripes）[18] [19]。在Oreochromis niloticus中，PKR已被证明能有效抑制草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的复制[20]。在最近对橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的研究中，通过体外实验探讨了PKR表达与病毒感染之间的关系[21]。研究结果表明，PKR影响干扰素调节因子（IRFs）和干扰素刺激基因（ISGs）的表达。此外，PKR表达升高可以激活IFN、ISRE和NF-κB的启动子，突显了其在抗病毒反应中的潜在作用[21]。然而，这些发现仅限于体外研究；目前尚无体内研究来探讨PKR在活体石斑鱼中的作用，尤其是在神经系统中的作用。此外，病毒dsRNA与PKR之间的具体关系仍不明确；体内研究中没有证据证实PKR直接与病毒成分相互作用或通过eIF2α磷酸化发挥抗病毒作用。
为了全面阐明PKR在石斑鱼神经系统中对抗NNV感染的免疫功能和抗病毒反应，需要进行体内研究。因此，本研究旨在探讨PKR在巨型石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）神经系统对抗NNV的抗病毒反应中的作用，巨型石斑鱼是一种受NNV感染严重影响的重要水产养殖物种。特别是，我们希望明确PKR与NNV dsRNA之间的相互作用及其对eIF2α磷酸化的影响。研究PKR介导的抗病毒机制，尤其是在大脑中的机制，可以为神经免疫相互作用提供新的见解，这可能有助于开发针对养殖鱼类神经系统进行抗病毒治疗的新策略。
章节摘要
鱼类饲养和样本采集
巨型石斑鱼从台湾台南的一家当地渔场获得。经过NNV检测确认这些鱼未感染NNV后，将它们置于28°C和35‰盐度的环境中适应一周。在多聚(I:C)和脂多糖（LPS）挑战实验中，体长为6.0 ± 1厘米的幼鱼在28°C和35‰盐度的环境中接受腹腔注射，每条鱼注射50 μL多聚(I:C)（1 mg/mL，溶于磷酸盐缓冲液[PBS]）；
PKR基因的选择和特征分析
巨型石斑鱼PKR基因（ggPKR；基因库ID：PP066045）的全长cDNA序列显示，其开放阅读框（ORF）为1,569 bp，编码522个氨基酸的蛋白质（图1A）。SMART结构域分析显示，ggPKR包含两个双链RNA结合 motif（DSRM），分别位于氨基酸2-68和119-185处，以及一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域（S_TKc），位于残基218和503之间（图1B, C）。SWISS-MODEL蛋白结构建模显示…
讨论
作为水生生物，鱼类直接受到环境盐度的影响。在我们的体内实验中，盐度的变化减少了ggPKR的表达，这使我们推测PKR的功能可能与鱼类的自然栖息环境有关。PKR不仅存在于淡水鱼类（如斑马鱼Danio rerio和金宝贝鱼Tetraodon nigroviridis）[29]中，也存在于海水鱼类中，如条纹喙鱼Oplegnathus fasciatus[19]和虎河豚Takifugu rubripes[20]
结论
总体而言，我们的研究结果表明，NNV感染会触发神经环境中的干扰素通路激活，增强神经元的抗病毒防御能力，并进一步揭示了病毒感染期间神经免疫的动态。我们的结果显示，NNV感染的巨型石斑鱼的大脑和眼组织中PKR表达升高，支持了PKR在神经免疫反应中的作用。即使在高度保护的区域（如大脑）中，PKR也…
伦理声明
本研究遵循以下动物福利和/或报告指南：台湾农业委员会制定的《实验室动物护理和使用指南》，2018年。本研究得到了国立成功大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号IACUC 103084）。
李思贤（Sih-Shien Lee）：验证、数据分析、数据可视化、实验设计、初稿撰写。陈宗月（Tzong-Yueh Chen）：概念构思、方法设计、软件使用、资源筹备、论文审阅与编辑、项目管理和资金申请。
致谢
本研究得到了国家科学技术委员会（ MOST）、 MOST（109-2321-B-006-019）、 NSTC（112-2313-B-006-006-MY3）、 NSTC（113-2640-B-006-002）和 NSTC（114-2640-B-006-002）以及国立成功大学大学发展办公室的支持，资金由教育部提供。作者感谢LSM共聚焦激光扫描显微镜在国立成功大学核心设施中心的使用。
Sih-Shien Lee | Tzong-Yueh Chen
