具有在日本鲈中诱导免疫耐受潜力的 TM 低致敏性酶产品的开发

《Food Bioscience》：Development of TM hypoallergenic enzymatic products with the potential to induce immune tolerance in Lateolabrax japonicus

　　

摘要 鱼类肌动蛋白（TM）作为一种重要的鱼类过敏原，正引起越来越多的关注。因此，有效降低 TM 的致敏性并诱导免疫耐受，有利于预防和控制鱼类引起的过敏。本研究以中国养殖鱼类鲈鱼（Lateolabrax japonicus）为研究对象。通过生物信息学预测与 T 细胞增殖实验相结合，鉴定出 TM 中的 6 个 T 细胞线性表位，其中 L39-E54、Q201-E212、E222-E236 和 L265-D275 被鉴定为关键 T 细胞表位。基于已验证的抗原表位，分析了 TM 表位上 6 个食品级蛋白酶切割位点的分布。根据保留 T 细胞表位同时破坏 B 细胞表位的修饰策略，最终选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶进行后续酶解实验，分别命名为 N-TM、P-TM 和 T-TM。通过点印迹法评估了 3 种酶解产物的 IgE 结合能力。与 TM 相比，所有 3 种样本的 IgE 结合能力均显著下降，其中 P-TM 和 T-TM 下降最为显著，而 N-TM 仅表现出微弱的结合活性。此外，这些酶解产物能够刺激 CD4+ T 细胞增殖（N-TM：24.3%±3.2%，P-TM：32.4%±2.1%，T-TM：24.1%±3.1%）。其中，P-TM 在细胞上清液中 IL-10 的释放量最高（0.56±0.05 ng/mL），表明其具有诱导免疫耐受的最强潜力。研究结果旨在为开发针对预防和缓解鱼类源性过敏反应的功能性食品和免疫调节剂提供理论支持。

引言 食物过敏已成为一个重大的公共卫生问题。它是指人体对特定食物中存在的蛋白质产生的异常免疫反应，通常会引发影响多个系统的症状，如皮肤、呼吸道、胃肠道和心血管系统（Anvari 等，2019）。大多数食物都可能引发过敏；然而，联合国粮农组织和世界卫生组织共同确定的八大类主要致敏食物主要包括牛奶、花生、坚果、小麦、鸡蛋、芝麻、甲壳类和鱼类（FAO W，2021）。在鱼类中，过敏原存在于肌肉、皮肤、骨骼、精液和血液中。截至 2025 年 5 月，世界卫生组织/国际免疫学联盟过敏原命名小组委员会数据库（WHO/IUIS，https://www.allergen.org/）已正式记录并命名了来自 22 种鱼类的 12 种过敏原，如小清蛋白、β-烯醇酶、醛缩酶 A 和肌动蛋白（TM）。

鱼类 TM 的致敏性自 2013 年以来开始引起显著关注（Liu 等，2013）。许多研究分析了鱼类 TM 的 IgE 结合频率（González-Fernández 等，2018；Ruethers 等，2021；Taki 等，2023）。此外，近年来也报道了鱼类 TM 的抗原表位。抗原表位是指抗原分子上独特的化学结构，负责定义抗原的特异性，主要位于蛋白质表面。根据免疫反应期间免疫细胞的识别特征，表位被进一步分为 T 细胞表位和 B 细胞表位（Zhou 等，2021）：T 细胞表位由抗原呈递细胞呈递给 T 细胞并调节免疫反应的方向，这些表位仅由线性表位组成；B 细胞表位包括线性表位和构象表位，可诱导特异性 IgE 抗体的产生，从而触发过敏反应。Keshavarz 等（2020）鉴定了大西洋鲑鱼 TM 的 2 个 B 细胞线性表位。Xu 等（2020）验证了黄鱼 TM 的 3 个 B 细胞线性表位。Li 等（2025）也确认了鲈鱼 TM 的 7 个 B 细胞线性表位。然而，鱼类 TM 的 T 细胞表位尚未见报道。对抗原表位定位的分析对于生产低致敏性食品和制定过敏原特异性免疫疗法的新策略具有重要意义。

迄今为止，鱼类过敏仍没有标准化的治疗方法。有效降低过敏原的致敏性对于预防和控制鱼类诱发的过敏反应具有重要的实际意义。食品加工技术已广泛应用于降低过敏原致敏性的研究中（Liang 等，2021；Zhao 等，2022）。酶解技术不仅通过改变过敏原结构破坏其构象表位，还通过特异性切割氨基酸残基消除其线性表位，从而有效降低其致敏性（Zeng 等，2025）。然而，各种蛋白酶在过敏原结构内的切割位点分布不同，导致结构和表位破坏程度不同，最终导致对致敏性的影响不同。生物信息学技术的快速发展克服了酶切位点不清楚从而影响过敏原致敏性的情况（Liu 等，2025）。因此，有必要使用生物信息学技术评估各种蛋白酶对鱼类 TM 表位的破坏程度，以筛选出蛋白酶并有效降低 TM 的致敏性。

值得注意的是，过敏原的酶解产物在诱导免疫耐受方面显示出显著潜力。Wu 等（2025）通过胰蛋白酶处理获得了低致敏性的 Cra a 4 酶解产物。由于其存在 T 细胞表位，该产物表现出刺激 T 细胞增殖的能力，显示出诱导免疫耐受的潜力。Tian 等（2023）也发现，在用胰蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶对β-乳球蛋白进行酶解后，3 种水解产物的致敏性因 B 细胞表位的破坏而降低，而这些产物富含 T 细胞表位，显示出诱导免疫耐受的潜力。因此，通过在降低过敏原致敏性的同时保留或产生 T 细胞表位，可以在确保安全的前提下在体内诱导免疫耐受，从而实现脱敏。然而，保留 T 细胞表位的低致敏性酶解产物在鱼类 TM 的免疫耐受诱导研究中尚未引起广泛关注。

鲈鱼蛋白质丰富，肉质鲜美，是常见的海洋经济鱼类之一。然而，鲈鱼肌肉中存在的过敏原 TM 使其能够引发过敏，目前已鉴定出 7 个 B 细胞表位（AA22-39，AA51-64，AA77-86，AA176-183，AA197-203，AA209-222，AA232-241）（Li 等，2025）。到目前为止，对 TM 的 T 细胞表位仍缺乏全面的阐明。在本研究中，基于 TM 序列预测 T 细胞表位，并使用 T 细胞增殖实验进行鉴定。基于已鉴定的表位，通过利用生物信息学技术的修饰策略筛选蛋白酶。该策略保留 T 细胞表位同时破坏 B 细胞表位，以制备 TM 酶解产物。表征 TM 酶解产物的理化性质和结构变化，并使用点印迹法评估其致敏性潜力的变化。采用 T 细胞增殖实验评估 TM 酶解产物的 T 细胞刺激能力和细胞因子释放水平，旨在研究其诱导免疫耐受的潜力。

部分片段
材料 辣根过氧化物酶（HRP）山羊抗小鼠 IgE 由 Abcam（英国伦敦剑桥）提供。HRP-山羊抗人 IgE 抗体购自 Southern Biotech（美国阿拉巴马州伯明翰）。APC-Cy7-抗小鼠 CD3、APC-抗小鼠 CD4 和 Percp/cy5.5-抗小鼠 CD44 购自 Biolegend（美国加州圣地亚哥）。白细胞介素（IL）-4 ELISA 试剂盒购自 Neobioscience（中国广东深圳）。干扰素（IFN）-γ、IL-2 和 IL-10 ELISA 试剂盒购自 Univ-bio 公司

鲈鱼 TM 的 T 细胞表位预测与鉴定 使用 3 个在线工具预测 TM 的 T 细胞表位，结果见表 2。选择由两个或更多软件工具预测的重叠区域作为 TM 的潜在 T 细胞表位。最后，筛选并合成了 7 个预测的 T 细胞表位（10-21，39-54，83-94，162-178，201-212，222-236，265-275），并命名为 P1-P7 进行验证（表 3）。

为了验证预测的 T 细胞表位，从 TM 致敏

讨论 作为过敏反应的分子基础，过敏原表位的鉴定不仅有助于系统地探索过敏机制，还是开发有效致敏性减弱策略的必要前提（Sun 等，2024）。目前，对于鲈鱼主要过敏原 TM 的抗原表位还没有系统研究。

随着计算技术的快速发展，丰富的生物信息学分析工具

结论 简言之，系统地验证和分析了鲈鱼 TM 的抗原表位，增强了对鱼类过敏原致敏的理解，同时为鱼类、甲壳类、软体动物和节肢动物之间的交叉反应性提供了理论见解。在此基础上，通过采用利用 T 细胞表位同时破坏 B 细胞表位的修饰策略，初步筛选了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶来制备 TM 酶解产物。3 种酶解产物的免疫结合能力

CRediT 作者贡献声明 陈桂霞：资源。刘光明：写作 – 审查与编辑，项目管理，经费获取，概念化。李梦思：写作 – 审查与编辑，写作 – 原稿起草，方法论，调查，经费获取，形式分析，概念化。刘青美：写作 – 审查与编辑，调查，经费获取，概念化。夏飞：写作 – 审查与编辑，调查，概念化。黄苏杰：调查，概念化。

未引用参考文献 Bublin 等，2018；FAO，2021；Li 等，2025；Mederos-Luis 等，2024；Sun 等，2024。

利益冲突声明 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或可能影响本论文报告工作的个人关系。

数据可用性 应要求提供数据。

利益冲突声明 ? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或可能影响本论文报告工作的个人关系。

致谢 本工作得到了漳州科技学院博士启动基金（ZZYB2304）、国家自然科学基金（32472449，32472449）、福建省中青年教师教育科学科研项目（JZ230085）、漳州科技学院水产品研究创新团队（ZZYT23014）以及漳州市科学技术协会青年科技人才支持计划的资助。

李梦思 | 刘青美 | 夏飞 | 黄苏杰 | 林顺先 | 钟立强 | 张浩天 | 陈桂霞 | 刘光明
中国福建省漳州市漳州科技学院食品工程学院，邮编 363000