转谷氨酰胺酶与氯化镁协同改性大豆分离蛋白：一种针对致敏性与消化性双重益处的序贯处理策略

《Food Chemistry》：Synergistic modification of soy protein isolate using transglutaminase and magnesium chloride: A sequential treatment strategy for dual allergenicity and digestibility benefits

　　

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  顺序 TGase-MgCl₂ 处理显著改变了 SPI 的构象。
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  联合策略显著降低了大豆蛋白的致敏性。
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  顺序处理增强了蛋白质的消化性和小肽的释放。
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  协同效应优于单独的 TGase 或 MgCl₂ 处理。

引言

大豆是全球植物蛋白的重要来源。大豆蛋白分离物（SPI）因其营养品质和多功能特性而备受推崇，被广泛用于许多食品产品中，包括肉类似物、乳制品替代品和膳食补充剂 (Zheng et al., 2022)。然而，大豆过敏影响约 0.5% 的大众，儿童表现出更高的易感性，从而给食品制造商和消费者都带来了巨大的挑战 (Pi et al., 2021)。大豆中的主要过敏原蛋白是 Gly m 4、Gly m 5（β-伴大豆球蛋白）和 Gly m 6（大豆球蛋白），它们负责大多数免疫球蛋白 E (IgE) 介导的过敏反应 (Wiederstein et al., 2023)。值得注意的是，储存蛋白β-伴大豆球蛋白 (7S) 和大豆球蛋白 (11S) 占总大豆蛋白的高达 70%，含有多个免疫显性表位。因此，开发有效策略以降低 SPI 的致敏性，同时保持或增强其营养价值，仍然是食品科学中的一个关键挑战。

目前用于降低大豆致敏性的食品加工技术，包括热处理、高压处理、发酵和酶催化，由于某些大豆过敏原的显著稳定性，显示出不同的有效性 (Pi et al., 2021)。补充表 S1 总结了这些常见加工技术的机制、效力和实际局限性。新兴的物理加工技术也引起了关注；例如，高强度脉冲磁场已被证明可以改变蛋白质 - 淀粉相互作用并提高植物基食品的质量 (Liu et al., 2025)。其中，使用转谷氨酰胺酶 (TGase) 进行酶法改性显示出相当大的前景。

主要的大豆过敏原包含构象和线性 IgE 结合表位。TGase 催化的交联在赖氨酸和谷氨酰胺残基之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键。该反应可以：(i) 通过改变多肽链的空间排列直接修饰或屏蔽构象表位；(ii) 将线性表位埋入交联聚集体的内部；以及 (iii) 可能交联相邻表位，造成抗体结合的空间位阻 (Ahmed et al., 2021)。在β-伴大豆球蛋白中，α 和 α' 亚基富含赖氨酸/谷氨酰胺，因此是良好的 TGase 底物，而β亚基的可及残基较少。对于大豆球蛋白，酸性亚基比碱性亚基更容易受到 TGase 交联 (Hsieh et al., 2014)。越来越多的证据支持 TGase 在减轻大豆致敏性方面的效力。例如，Zhang 等人 (2021) 报告称，TGase 交联大豆蛋白水解物显著降低了 IgE 结合能力，同时改善了感官特性。Bai 等人 (2024) 发现，通过 TGase 交联的豆腐凝胶通过促进肠道黏膜内的免疫耐受，减轻了小鼠模型中大豆引发的过敏反应。尽管 TGase 处理前景广阔，但单独应用通常需要延长的反应时间和相对较高的酶浓度才能实现显著的致敏性降低，这可能会增加生产成本并影响蛋白质功能。这些局限性需要互补策略来增强 TGase 的效力。

相反，使用氯化镁 (MgCl₂) 等盐类的离子诱导是豆腐生产中的常见凝固方法 (Geng et al., 2024)。Mg²⁺ 离子中和豆浆蛋白的表面电荷，消除静电排斥，促进蛋白颗粒与油体的吸附和聚集 (Koyano et al., 2025)。然而，单独使用 MgCl₂ 降低致敏性的效力存在争议。一些研究报告称，盐诱导的聚集仅仅是沉淀蛋白质，而不破坏致敏表位，并且它可能产生致密、消化性较差的聚集体，从而限制营养生物可及性 (Rui et al., 2016; Zhu et al., 2019)。这些互补的局限性，包括与 TGase 的高成本和部分效力相比，MgCl₂ 的表位破坏能力差和消化性可变，突显了需要一种协同方法，将 TGase 的表位共价屏蔽与 MgCl₂ 诱导的结构压实相结合。

虽然 TGase 和 MgCl₂ 等二价盐的单独作用已被研究，但它们潜在的协同相互作用受到的关注有限。一个关键问题仍然是酶交联和离子凝固是独立作用还是可以战略性地结合，以产生更深刻和稳定的大豆蛋白致敏潜力降低。Tang 等人 (2023) 之前的工作比较了单独由 MgCl₂ 诱导或与 TGase 结合诱导的豆腐，指出了理化性质的差异，但仍需要一项综合调查，将这种顺序处理诱导的特定结构修饰与致敏性和消化性的变化联系起来。此外，尚不清楚这种联合处理是否可能形成难消化的聚集体，屏蔽过敏原免受蛋白水解，或者创造一种最终增强蛋白质分解并减少 IgE 结合的基质。

基于上述考虑，我们假设顺序应用 TGase 然后 MgCl₂ 将诱导两阶段结构转变：(i) TGase 首先催化相邻蛋白质分子之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，生成共价交联的高分子量蛋白网络，而不引起整体聚集；(ii) 随后添加 Mg²⁺ 离子中和交联蛋白表面的负电荷，减少静电排斥，促进进一步压实成致密的离子诱导聚集体。这种顺序机制预计会产生具有独特性质的蛋白质基质。因此，本研究旨在系统调查顺序用 TGase 和 MgCl₂ 处理的 SPI 的结构修饰、致敏性降低和 in vitro 消化稳定性。具体来说，我们表征了蛋白亚基组成、二级结构、分子间力和游离巯基的变化。致敏性通过抗原性和 IgE 结合能力测量进行评估，而修饰蛋白的消化行为在整个模拟胃肠道消化过程中被监测。这项工作为酶法和离子修饰策略之间的潜在协同作用提供了新的见解，为设计低致敏性大豆基食品配料提供了一种有前途的方法。

章节片段

材料

大豆蛋白分离物 (SPI, 92.8% w/w 蛋白) 购自山松生物制品有限公司 (中国临沂)。转谷氨酰胺酶 (TGase, 100?U/g) 购自东升生物技术有限公司 (中国泰州)。氯化镁 (MgCl₂) 由连云港日丰钙镁有限公司供应 (中国连云港)。试剂包括双缩脲法 (BCA) 蛋白测定试剂盒 (PC0020)、胃蛋白酶 (P8390)、α-淀粉酶 (G8290)、胰酶 (P7340) 和猪胆盐 (G8310) 购自

不同凝固剂凝固的 SPI 的 SDS-PAGE 分析

进行 SDS-PAGE 以分析用 TGase (ST)、MgCl₂ (SM) 或 TGase 处理后 MgCl₂ 处理 (STM) 顺序处理凝固的 SPI 的电泳图谱，以未处理的 SPI 作为对照。如图 1 所示，在未处理的 SPI 泳道中观察到对应于β-伴大豆球蛋白亚基 (7S α', 7S α, 7S β) 和大豆球蛋白亚基 (11S A₃, 11S 酸性，11S 碱性) 的明显条带，分子量范围约为 15 到 100?kDa (Hsieh et al., 2014)。

结论

本研究表明，顺序用 TGase 和 MgCl₂ 处理协同修饰了 SPI 的结构和免疫学特性，导致致敏性显著降低，同时调节其消化性特征。联合 (STM) 方法促进了广泛的蛋白质交联和聚集，导致显著的构象变化和最低的 IgE 结合能力。在模拟消化过程中，STM 样品表现出延迟的胃水解，但最终

CRediT 作者贡献声明

邢广亮：写作 - 审阅与编辑，写作 - 原始草稿，可视化，监督，软件，资源，资金获取，形式分析，概念化。孙月：验证，方法论，调查，数据整理。刘佳：验证，调查，形式分析，数据整理。

竞争利益声明

作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响了本文报道的工作。

致谢

本研究获得了 江苏省自然科学基金 (批准号 BK20241073) 和苏州科技大学研究启动基金 (批准号 KYZ2019036Q) 的财务支持。

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已获得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，同意参与本研究并发表文章。

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根据相关法律和机构指南，无需伦理委员会批准。本研究使用了商业购买的、去标识化的人类血清，来自

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