双管多重 TaqMan 实时 RT-PCR 在贝类食源性病毒同时检测中的应用

《Food Control》：The Use of Double-tube Multiplex TaqMan Real-time RT-PCR for the Simultaneous Detection of Foodborne Viruses in Shellfish

　　

摘要

诺如病毒 (NoV)、A 组轮状病毒 (RVA)、甲型肝炎病毒 (HAV)、人类星状病毒 (HAstV)、戊型肝炎病毒 (HEV) 和人类sapovirus (HuSaV) 是导致急性肠胃炎爆发的主要食源性病毒。贝类是这些病毒的重要储存库。可靠的检测方法对于及时识别和监测贝类及其他水产品中的病毒至关重要。本研究建立了一种高特异性和敏感性的双管多重 TaqMan 实时 RT-PCR (mRT-qPCR) 检测方法，用于同时检测多种食源性病毒。引物和 TaqMan 探针从高度保守的序列中设计，并优化了双管格式以进行组检测。该方法在目标病毒之间或与无关病原体之间没有交叉反应，并表现出优异的特异性、敏感性、重复性和再现性。NoV GI 的检出限约为 1.1 拷贝/μL，NoV GII 约为 7.5 拷贝/μL，RVA 约为 1.4 拷贝/μL，HAV 约为 1.1 拷贝/μL，HEV 约为 1.5 拷贝/μL，HAstV 约为 1.1 拷贝/μL，HuSaV 约为 1.6 拷贝/μL。所有病原体的变异系数均 < 3.6%，且线性良好 (R² ≥ 0.96)。共收集了 1,988 份贝类样本，来自渤海湾和中国南方的沿海城市。阳性率分别为：NoV GI 0.05% (1/1,988)，NoV GII 7.65% (152/1,988)，RVA 0.86% (17/1,988)，HAV 0% (0/1,988)，HEV 2.41% (48/1,988)，HAstV 3.82% (76/1,988)，HuSaV 1.11% (22/1,988)。NoV GII 和 HAstV 的流行率最高。这种双管 mRT-qPCR 检测方法为检测贝类中的食源性病毒提供了一种高效可靠的方法，为食品安全监测提供了强有力的技术支持。

引言

食源性疾病仍然是全球主要的食品安全问题，每年影响约 6 亿人，并导致约 125,000 例五岁以下儿童死亡 (Wang et al., 2021; Olaimat et al., 2024)。食源性病毒是这些疾病的主要贡献者，构成了重大的公共卫生威胁 (Kim et al., 2023)。主要病毒包括诺如病毒 (NoV GI 和 GII)、A 组轮状病毒 (RVA)、甲型肝炎病毒 (HAV)、戊型肝炎病毒 (HEV)、人类星状病毒 (HAstV) 和人类 sapovirus (HuSaV) (Suther et al., 2022; Chatonnat et al., 2023; Trudel-Ferland et al., 2024)。NoV、RVA、HAstV 和 HuSaV 主要引起伴有呕吐和腹泻的急性肠胃炎 (Li et al., 2025)，而 HAV 和 HEV 导致中心性肝炎 (Traore et al., 2024; Chowdhury et al., 2019; Di Cola et al., 2021)。这些病毒的特点是感染剂量低，主要通过粪 - 口途径传播 (Bosch et al., 2016; Ekundayo et al., 2023; Graziano et al., 2021)。病毒颗粒存在于人类粪便中，一旦释放到环境中即可致病 (Simhon et al., 2020)。

滤食性贝类 (如牡蛎、扇贝、蛤蜊) 是这些病毒的关键载体 (La Bella et al., 2017)，通过滤食作用将病毒浓缩至海水中水平的 1,000-100,000 倍 (Sun et al., 2022; Yu et al., 2023)。靠近受人类活动影响的沿海地区会增加病毒污染的可能性 (Bosch et al., 2016; Costantini et al., 2006)。这些病毒具有稳定性，在冷链运输条件下可存活很长时间并保持感染力 (Sun et al., 2022; Yang et al., 2024; Larocque et al., 2022)。当贝类生食或轻微烹饪食用时，风险特别高 (Govaris et al., 2021; Gyawali et al., 2019)。众多与贝类相关的散发和爆发病例凸显了有效监测和控制的必要性 (Yu et al., 2023; Mangeri et al., 2024; Rexin et al., 2024; Cho et al., 2018; Guarines et al., 2020)。

早期检测是防止食源性病毒爆发的中心环节。有效的诊断方法应结合高敏感性、强特异性、安全性、速度和简便性 (Stoufer et al., 2024; Cecillon et al., 2024; Plante et al., 2021)。现有的检测方法包括电子显微镜 (如 TEM) (Kapikian et al., 1972)、免疫分析 (如 ELISA) (Geginat et al., 2012; Sanz et al., 2008)、分子生物学技术 (如 RT-PCR、液滴数字 PCR、CRISPR/Cas13a) (Persson et al., 2021; Han et al., 2022; Li et al., 2023; Duan et al., 2022)、基因芯片方法 (如 NGS) (Schmitz et al., 2023) 和生物传感器 (如光学生物传感器) (Long et al., 2024; Wang et al., 2021; Janicka et al., 2024)。然而，许多方法耗时、昂贵、效率低下或无法同时检测多种病毒。定量 TaqMan 实时 RT-PCR (RT-qPCR) 因其快速、自动化和高敏感性而常用于 RNA 病毒检测 (Dung et al., 2013; Yoo et al., 2017)。它允许实时定量核酸，能够实现食源性病毒的高通量测试 (Wang et al., 2025; Monteiro et al., 2018; Coudray-Meunier et al., 2015)。多重 RT-qPCR (mRT-qPCR) 通过在一次检测中检测和区分多种病原体扩展了这种能力 (Kowada et al., 2018; Bennett et al., 2017; Chou et al., 2018)。

本研究开发了一种使用 TaqMan 探针的双管多重 mRT-qPCR 检测方法，使用 3/4 通道荧光 qPCR 仪检测并定量水产品中的七种主要食源性病毒 (NoV GI、NoV GII、HAV、HEV、HAstV、HuSaV 和 RVA)。我们评估了其特异性、敏感性、重复性和再现性，并将该检测方法应用于中国七个省/直辖市的 1,988 份贝类样本。所得监测数据用于评估贝类消费的人类健康风险并识别潜在污染源。

章节片段

病毒和细菌菌株

NoV GI、NoV GII、HAV、HAstV、HuSaV、RVA、HEV 的阳性样本是从我们实验室之前检测为阳性的真实食品样本中获得的，包括牡蛎、扇贝、蛤蜊、生猪肉、活 rand 和生菜。这些食品样本是在 2022 年至 2024 年间进行的独立监测和方法验证研究中收集的。这些食品样本的阳性结果最初通过 RT-qPCR (Ct 值 < 35) 或针对保守病毒基因组区域的 RT-PCR 确认。该

食源性病毒 RNA 标准的制备

提取标准质粒并测量其浓度，随后进行相应 cRNA 的体外合成。每微升 RNA 拷贝数使用以下公式计算：每 μL RNA 拷贝数 = RNA 浓度 (ng/μL) × 6.02 × 10²³ ×10^-9 / (RNA 长度 × 340)。所得 RNA 标准的拷贝数分别为：NoV GI 为 1.45 × 10¹⁰ 拷贝/μL，NoV GII 为 1.0 × 10¹⁰ 拷贝/μL，RVA 为 1.87 × 10¹⁰ 拷贝/μL，HAV 为 1.415 × 10¹⁰ 拷贝/μL，HEV 为 1.95 × 10¹⁰ 拷贝/μL，1.5 ×

讨论

食源性疾病是全球食品安全的主要关注点。世卫组织报告称，发达国家近 30% 的人口每年受此类疾病困扰，发展中国家的情况甚至更为严重 (Abebe et al., 2020)。NoV GI、NoV GII、RVA、HAV、HEV、HAstV 和 HuSaV 等食源性病毒是这些疾病的主要原因，在全球范围内造成了重大的公共卫生和经济负担 (Suther et al., 2022; Manouana et al., 2021; Tenge et al.,

结论

本研究开发了一种快速、敏感、特异、可重复和可再现的双管 mRT-qPCR 方法，用于在统一的热循环协议下的两个平行反应系统中同时检测 NoV GI、NoV GII、RVA、HAV、HEV、HAstV 和 HuSaV。该检测方法在贝类样本测试中表现出强大的适用性，能够快速并差异性地检测食源性病毒。

CRediT 作者贡献声明

万强: 写作 - 回顾与编辑，验证，监督，调查。 蔡志和: 写作 - 回顾与编辑，验证，监督。 陈牧童: 写作 - 回顾与编辑，可视化，监督，项目管理，方法论，调查，资金获取，构思。 吴青萍: 写作 - 回顾与编辑，可视化，监督，项目管理，方法论，调查，资金获取，构思。 陈玲: 写作 - 回顾与

未引用参考文献

Bennett and Gunson, 2017; Cecillon and Nasheri, 2024; Chou and Williams-Hill, 2018; Ekundayo and Ijabadeniyi, 2023; Govaris and Pexara, 2021; Monteiro and Santos, 2018.

利益冲突声明

作者声明没有竞争利益。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些可能被认为影响了本论文中报告的工作。

致谢

本项目得到了 国家自然科学基金 (32302248)、中国博士后科学基金 (2023M730733)、渤海大学海洋研究院 开放基金 (BDHYYJY2020001) 和辽宁省教育厅基本科研业务费青年项目 (LJ212510167010) 的支持。

林鹏|陈玲|万强|蔡志和|薛亮|叶清华|姜福峰|曲晓颖|黄佳惠|黄惠书|丁羽|陈牧童|吴青萍

广东环凯微生物科技有限公司，中国广州 510663