## 中文标题 清洁与消毒程序对控制肉鸡舍弯曲杆菌污染的效果

《Food Microbiology》：Efficacy of cleaning and disinfection procedures for controlling Campylobacter contamination in broiler chicken sheds

　　

弯曲杆菌病(campylobacteriosis)是新西兰通报率最高的食源性疾病，家禽是主要的暴露来源。本研究评估了现行行业清洁与消毒方法在消除肉鸡舍弯曲杆菌(Campylobacter)污染及防止批次间传播方面的有效性。卫生指示物检测(h hygiene indicators)与清栏审计(cleanout audits)确定了清栏改进的优先区域。研究人员从两个农场的各两栋鸡舍中，在连续批次鸡只及清栏前后的鸡舍环境中采集盲肠(caeca)样本。样本分别通过培养法、定量PCR(quantitative PCR, qPCR)和存在/缺失PCR(presence/absence PCR)检测弯曲杆菌。弯曲杆菌检出率因采样位置不同而存在显著差异(p<0.001)，其中乳头饮水器(nipple drinkers)检出率最高(20/64，31%)，其次为附属区(annex areas)(10/64，16%)。清洁与消毒后检出率显著降低(清栏前320份样本中71份阳性[22%]，清栏后320份样本中3份阳性[1%]；p<0.001)。基因组分析鉴定出7种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)序列型(sequence types, STs)，并显示盲肠分离株与同一饲养周期内鸡舍环境中的分离株相匹配。未检测到菌株在连续批次之间残留的基因组证据；然而，同期批次间跨鸡舍传播的证据表明，污染主要由农场内再引入驱动，而非生产周期间的持续残留。尽管10株弯曲杆菌分离株携带耐药相关RE-cmeB等位基因，但无证据表明该基因影响消毒剂敏感性。这些发现提供了新的现场证据，区分了持续残留与传播途径，并强调针对高风险接触界面和跨鸡舍传播途径进行防控可能比进一步强化清洁程序更能有效降低弯曲杆菌定植。

## 论文解读

### 一、研究背景与问题

弯曲杆菌病(campylobacteriosis)是全球范围内最常见的细菌性胃肠炎病因之一，主要由空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲杆菌(C. coli)引起。在新西兰，弯曲杆菌病是最常通报的食源性疾病，发病率高于其他高收入国家，约84%的人类病例归因于家禽来源。新西兰肉鸡生产几乎完全为国内供应，具有高度垂直一体化的生产结构，四家公司控制着超过95%的产量和供应链的大部分环节。尽管行业标准化程度较高，但不同农场和生产周期之间弯曲杆菌的定植和持续存在仍存在差异，反映出农场特异性风险因素和潜在的跨农场传播途径。

控制肉鸡弯曲杆菌的关键机制之一是在初级加工过程中应用抗菌清洗步骤。新西兰初级产业部实施的弯曲杆菌风险管理策略以及生物安全、屠宰和加工方面的改进，使2006年至2008年间弯曲杆菌病发病率降低了约50%。然而，在农场层面预防或延缓肉鸡定植，可最大限度地减少弯曲杆菌进入加工生产线，减少对初级加工措施的依赖。新西兰家禽业协会与初级产业部合作制定了农场生物安全措施，这些措施在降低沙门氏菌(Salmonella)检出率方面取得了成功，但控制弯曲杆菌更具挑战性，因为其定植的风险因素、来源和传播途径众多。

研究人员此前在新西兰某农场调查了弯曲杆菌定植的载体和来源，发现研究鸡群的优势菌株C. jejuni ST6964与同鸡舍上一批鸡群的分离株以及同农场同龄对照鸡群的分离株高度匹配。然而，清栏后所有鸡舍样本均检测为弯曲杆菌阴性，提示清栏有效，但可能仍有少量存活的弯曲杆菌残留在未检测到的保护性生态位中。国际研究表明，清栏不彻底导致的鸡舍环境污染是污染新鸡群的高风险因素。此前一项新西兰研究在清栏和消毒后仍从鸡舍地板、喂料器、饮水器、通风口和风扇中检出弯曲杆菌，尽管检出率和浓度低于清栏前。清栏失败的原因包括设备设计不良、批次间隔时间不足、清洁方案知识有限或应用不当，以及细菌对常用消毒剂产生耐药性等。

本研究旨在评估新西兰现行行业清洁与消毒实践在消除肉鸡舍弯曲杆菌污染和防止连续生产周期间传播方面的有效性，通过整合卫生审计、微生物学和基因组学证据，调查残留污染是否持续存在于高风险鸡舍环境中，以及清栏前存在的菌株是否被携带至后续鸡群或通过替代途径再引入，并考虑抗菌素耐药决定因素在清洁后促进持续存在中的潜在作用。

### 二、主要技术方法

本研究采用多种互补的检测和分析手段：培养法用于分离活菌；定量PCR(qPCR)用于检测高浓度污染并确定菌种；存在/缺失PCR用于检测低浓度活菌；ATP生物发光检测作为卫生指示物评估清洁效果；全基因组测序(WGS)结合核心基因组多位点序列分型(cgMLST)、单核苷酸多态性(SNP)分析和泛基因组分析用于菌株间的系统发育比较。研究样本来自新西兰南岛两个不同公司的共四栋鸡舍。样本采集时间为2024年12月至2025年5月（南半球夏季和秋季），覆盖多个饲养周期，连续采集鸡群盲肠样本及鸡舍环境样本。

### 三、研究结果

**3.1 影响可清洁性的鸡舍因素与清洁实践**

研究发现鸡舍设计特征影响清洁效果。两农场部分鸡舍超过20年，地板裂缝、膨胀缝和墙裙裸露骨料区域被确定为潜在的微生物藏匿点。清洁和消毒程序在农场间基本相似，但执行人员和部分步骤存在差异。清栏后停养时间差异显著：C农场为36天，A农场仅7天。附属区因含电气部件，采用与鸡舍不同的清洁方法。

**3.2 清洁消毒监测指标**

卫生审计发现饮水样本普遍含有碎屑，表明水管冲洗无效。乳头饮水器老化变色并有残留物积累。墙壁和地板目视清洁，但裂缝中残留少量垫料。部分通风口有可见灰尘和蜘蛛网，风扇外壳经常有灰尘。A农场附属区清洁不及时，墙壁不洁且有大量蜘蛛网。ATP检测显示227份样本中103份(45%)超过公司设定的1,000相对光单位(RLU)阈值，地板(66%)、饲料装载机(70%)、风扇(63%)和乳头饮水器(63%)超标比例较高。

**3.3 肉鸡盲肠样本弯曲杆菌检出情况**

首轮饲养周期中，A农场6栋鸡舍和C农场4栋鸡舍均进行了盲肠检测以筛选鸡舍，最终选定A农场3号、6号鸡舍和C农场2号、4号鸡舍。220份盲肠样本中93份(42%)培养阳性，187份中85份(45%)qPCR阳性。弯曲杆菌浓度范围为5.0-9.5 log?? CFU/g。鸡群定植时间在不同鸡舍和周期间存在差异，定植日龄从27天到41天不等。C农场第二轮饲养周期中，即使最终 thinning 时盲肠样本也全部阴性，故终止了该农场的后续采样。

**3.4 清栏前后鸡舍环境样本弯曲杆菌检出情况**

清栏前320份样本中71份(22%)至少一种方法检出弯曲杆菌，清栏后320份中仅3份(1%)检出，差异极显著(p<0.001)。不同采样位置的检出率差异显著(p<0.001)，乳头饮水器最高(31%)，其次为附属区(16%)。清栏后仅从附属区鸡舍管理系统、A农场6号鸡舍墙裙（该位点清栏前也为阳性）和C农场2号鸡舍地板样本中检出。不同鸡舍和批次间清栏前检出率差异显著(p<0.001)，A农场6号鸡舍第一轮饲养周期后检出率最高(59%)，该鸡舍在清群当日采样；而C农场鸡舍因在清群后2-5天采样且部分清洁已开始，检出率极低。

**3.5 弯曲杆菌种类鉴定**

MALDI-TOF鉴定显示所有239株分离株均为空肠弯曲杆菌(C. jejuni)，WGS进一步确认了额外分离株。qPCR检测的所有阳性样本也均鉴定为C. jejuni。培养过程中频繁出现Ochrobactrum intermedium污染生长，可能影响弯曲杆菌的分离。

**3.6 弯曲杆菌分离株基因组比较**

对174株弯曲杆菌基因组进行WGS分析，鉴定出7种序列型(STs)，以ST45(32%)、ST474(29%)和ST583(22%)最为普遍。其中ST45、ST583和ST14794属于克隆复合体45(CC45)，占55%。系统发育分析显示ST45分为三个不同簇，分离度大(537-613个cgMLST等位基因差异)。多数ST簇内部克隆性高，差异不超过6个等位基因。同一饲养周期内盲肠分离株与同鸡舍环境分离株高度匹配或不可区分，支持鸡群与环境间的双向传播。相同ST在同期不同鸡舍的鸡群和环境间频繁检出，部分分离株完全一致。然而，同一鸡舍连续批次间未分离到相同ST，表明没有弯曲杆菌批次间残留的基因组证据，而同期鸡舍间传播和共同污染源是更重要的传播途径。

**3.7 抗菌素耐药决定因素分析**

所有基因组均含有β-内酰胺酶基因，分布与ST或ST45谱系相关。未检测到大环内酯类或氟喹诺酮类耐药相关点突变，未发现质粒。164株(94%)含有完整的CmeABC多药外排泵编码基因(cmeA、cmeB和cmeC)及阻遏蛋白基因cmeR。10株ST45分离株携带高度差异化的cmeB等位基因(RE-cmeB)，与耐药增强型RE-CmeB蛋白序列一致性达99.5%。药敏试验显示，携带RE-cmeB的菌株对萘啶酸的敏感性略低于其他ST45菌株，但对其他抗生素未显示耐药，对含苯扎氯铵的消毒剂Antigerm SA33的敏感性与对照菌株无差异，表明RE-cmeB的存在不会影响清栏消毒效果。

### 四、讨论与结论

本研究的核心发现是：现行清洁与消毒方法有效防止了弯曲杆菌在连续鸡群间的可检测残留传播，但农场内再引入和跨鸡舍传播才是鸡群定植的主要驱动因素。研究挑战了"清栏不彻底是弯曲杆菌复发的主要驱动因素"的传统假设，指出对高风险接触界面（特别是饮水系统、风扇通风口和附属区）和传播途径进行针对性控制是进一步降低风险的最佳机会。

研究发现乳头饮水器是清栏前污染最严重的位点，这与弯曲杆菌在潮湿环境中存活能力较强有关。饮水系统中大量生物膜和碎屑的存在表明水管冲洗方法未能有效清除生物膜，弯曲杆菌可整合入生物膜中抵抗包括氯处理在内的环境压力。附属区作为控制人员和野生动物传播的关键生物安全屏障，其清洁和维护的不足可能促进农场内传播。风扇和通风口的灰尘积累则提示这些位置在清洁过程中常被忽视。

基因组证据显示，同一菌株在同期不同鸡舍的鸡群和环境中重复检出，而连续批次间无残留，表明引入新菌株（可能通过捕鸡队及其设备）后在鸡群内扩增并传播至其他鸡舍的机制更为重要。研究还鉴定出RE-cmeB等位基因，虽然其赋予CmeABC外排泵功能增益并增加多药耐药性，但对消毒剂敏感性无影响。这项研究为行业提供了关键的防控方向：与其进一步强化清洁程序，不如将资源集中于高风险界面的针对性管理和传播途径的阻断。

本研究发表于《Food Microbiology》，为商业肉鸡生产中弯曲杆菌持续残留与再引入途径的区分提供了新的现场证据，对优化行业生物安全策略和降低食源性弯曲杆菌病负担具有重要意义。