水热孵育诱导的小麦谷蛋白肽淀粉样纤维化：通过多尺度结构与形态演变调控功能性质

《Food Hydrocolloids》：Hydrothermal incubation-induced amyloid fibrillation of wheat gluten peptide: regulation of functional properties via multi-scale structural and morphological evolution

　　

摘要
研究了不同纤维化条件对面筋肽淀粉样纤维（AFs）的多尺度结构和形态，及其功能特性的调节作用。结果表明，在 60 至 90 °C 的温度范围内孵育 0 至 36 小时后，面筋肽能够自组装成 AFs。原子力显微镜（AFM）图像显示，AFs 经历了形态演变，从蠕虫状、长而柔韧的形式和树突状、纠缠网络转变为刚性、棒状或无定形聚集体。提高温度可以显著加速纤维化过程并增加 AFs 的产量。在 90 °C 下孵育 36 小时后，硫黄素 T（ThT）荧光强度显著增加了 55.76%（p < 0.05）。圆二色谱证实纤维化伴随着构象转变，其中α-螺旋和无规卷曲逐渐转化为β-折叠结构。在 90 °C 下孵育 36 小时后，该结构的比例达到 36.09%。此外，延长孵育时间有助于形成粒径更大、分子量更高的 AFs。这些结构和形态上的差异进一步主导了 AFs 的功能特性。AFs 的形成显著降低了系统的溶解度。孵育 12 小时后形成的长而柔韧的 AFs 和孵育 24 小时后形成的丰富、纠缠的 AFs 网络表现出优异的起泡能力、乳化性能和粘度。然而，在高温下延长孵育（90 °C，36 小时）会引发淀粉样纤维的降解并损害其功能活性。这些发现阐明了孵育条件对面筋 AFs 结构和功能的调节机制，为其多样化应用提供了理论基础。

引言
淀粉样纤维（AFs）是蛋白质或肽通过错误折叠和自组装形成的高度有序、不溶性纤维状聚集体（Nelson & Eisenberg, 2006）。最初，AFs 在医学领域被广泛识别。它们通常被视为病理标志物，例如阿尔茨海默病中发现的 Aβ斑块（Dindar 等，2025）、帕金森病中发现的α-突触核蛋白沉积（Shreshtha 等，2025）以及 2 型糖尿病中发现的胰岛淀粉样多肽（Li & Zhang, 2025）。交叉β结构是其核心结构特征，赋予其高稳定性。人们还系统地研究了来自动物蛋白的 AFs 的形成条件、结构表征和纤维化机制。在低 pH 和高温加热条件下，动物蛋白也能形成 AFs，包括β-乳球蛋白、卵清蛋白和溶菌酶（Akkermans, Venema 等，2008a; Lara 等，2011, 2012）。

近年来，纤维化已成为植物蛋白修饰的有效策略。同样，大多数植物蛋白也可以在高温和强酸性条件下转化为 AFs，例如大豆蛋白（Yu 等，2024）、豌豆蛋白（Wu 等，2022）和米谷蛋白（Li 等，2024）。由于其独特的结构，AFs 可以显著改善蛋白质的各种功能特性。Li 等人发现米谷蛋白的纤维化显著改善了其乳化和起泡性能（Li, Wang, Geng 等，2021）。由玉米醇溶蛋白形成的半柔性 AFs 可作为高内相乳液体系的乳化剂，也可形成基于纤维的水凝胶（Li, Jin 等，2025）。脱酰胺大豆分离蛋白的 AFs 表现出增强的起泡能力、乳化活性和流变学性能（Ma 等，2026）。

人们普遍认为，大多数植物蛋白（如大豆蛋白、花生蛋白和豌豆蛋白）需要在强酸性环境（pH 2.0–4.0）下展开以产生肽；随后在 80–100 °C 加热促进淀粉样纤维的形成（Eslami 等，2026; Jia 等，2026; Yang 等，2023）。然而，与其他植物蛋白不同，小麦面筋不能仅通过调节温度和 pH 值进行纤维化。相反，它需要蛋白酶水解释放的疏水肽来促进纤维形成（Wang & Ma, 2026）。这是因为面筋蛋白富含谷氨酰胺、疏水氨基酸以及容易形成β-折叠的特征序列（Li 等，2026）。这些易于聚集的肽是其自组装成 AFs 的分子前提（Lambrecht 等，2021）。已验证面筋水解肽可以在水热条件下自组装成 AFs（Chen 等，2002）。此外，早期的研究验证了热处理（Bruun 等，2007）或转谷氨酰胺酶修饰（Bagagli 等，2014）可以诱导蛋白质从α-螺旋到β-折叠的构象转变。显然，小麦面筋蛋白具有有利于淀粉样纤维形成的内在结构基础（例如，其天然结构域富含谷氨酰胺且富含β-折叠结构）。值得注意的是，纤维化所需的这些不同 pH 要求主要归因于各种植物蛋白之间的结构差异。具体来说，小麦面筋水解肽组装成纤维是由具有高β-折叠倾向的短疏水肽与较长的亲水α-螺旋肽之间的疏水堆积相互作用介导的（Jansens 等，2019）。因此，具有内在纤维化倾向（富含谷氨酰胺和脯氨酸残基）的肽能够在温和的中性 pH 值下自组装成淀粉样纤维状纤维。基于这些发现，许多后续研究进一步验证了这一观察结果：胰蛋白酶消化的面筋肽（蛋白质浓度为 2.5% [w/v]，pH 7.0–8.0）能够形成淀粉样纤维（Liang 等，2025b; Ridgley 等，2011, 2012, 2014）。Monge-Morera 报道在 78 °C 下加热小麦面筋 22 小时诱导了长约 700 nm 的直纤维形成，而短期煮沸（15 分钟）促进了 1 至 2 μm 长的直纤维生成（Monge-Morera 等，2021）。Liang 等（2025b）发现，在煮沸条件下（0–7 分钟），AFs 的分子量和含量持续增加。此外，AFs 的形成受面筋成分、分子键、pH 值和离子强度的影响。在 37 °C，小麦面筋在 pH 8 下形成圆柱形纤维（Ridgley 等，2012）。纤维组装主要由疏水相互作用驱动。谷氨酰胺和赖氨酸残基通过氢键促进纤维扭曲和β-折叠富集。0.4% 的适当盐浓度促进面筋 AFs 的形成，加速从α-螺旋和无规卷曲到β-折叠的构象转变，并有利于长纤维的纵向生长（Liang 等，2023）。

值得注意的是，根据现有研究，用于小麦面筋蛋白淀粉样纤维化的热处理可分为三类：水热孵育、干热和煮沸。之前的研究已验证，可以从在 100 °C 煮沸后进行酶水解的面筋中提取淀粉样纤维。然而，这种纤维化途径大多在面条等基于小麦的食品产品加工中进行了研究（Liang 等，2023, 2025b, 2025c）。此外，最近一项模拟干热烘焙条件（95–205 °C）的研究表明，面筋的淀粉样结构随温度表现出不同的演变趋势：95 °C 时纤维生长缓慢；130 至 180 °C 时纤维形成加速，180 °C 时β-折叠结构含量达到最大值；205 °C 时部分纤维解体（Liu 等，2026）。相比之下，迄今为止，报道的大多数面筋淀粉样纤维都是通过水热条件（37, 45, 65, 78, 85 和 90 °C）下孵育形成的（Ridgley 等，2011; Ridgley, Ebanks & Barone., 2011; Ridgley 等，2012; Feng 等，2024; Monge-Morera 等，2021; Feng 等，2025; Zhang 等，2023; Liu 等，2023; Lambrecht 等，2021; Feng 等，2026; Athamneh & Barone, 2009a; Li, Kang 等，2025; Ren 等，2024; Liang 等，2025b）。因此，90 °C 是水热孵育的合理上限。低于 60 °C 的温度导致纤维化周期过长（数周到数月），不利于高效制备纤维。

然而，现有关于小麦面筋淀粉样纤维化的研究大多集中在单一固定温度下的条件分析，缺乏对不同水热温度诱导的纤维化过程的系统比较。此外，很少有研究系统地阐明孵育温度和时间在纤维化过程中如何协同调节面筋蛋白的结构转变和微观形态演变。淀粉样纤维（AFs）的多尺度结构演变与其功能特性之间的内在相关性仍知之甚少。因此，本工作选择 60–90 °C 的温度范围进行水热孵育。我们系统地探索了温度梯度（60, 70, 80 和 90 °C）和 0 至 36 小时的孵育时间对小麦面筋蛋白淀粉样纤维化过程和结构演变的影响。

本研究旨在系统研究孵育温度（60–90 °C）和时间（0–36 小时）对小麦面筋肽 AFs 的形成、结构特性和功能特性的影响。使用硫黄素 T 荧光测定法来表征 AFs 的自组装行为。应用原子力显微镜捕捉纤维化过程中的纤维形态，并进一步分析纤维长度和曲率的变化。随后采用圆二色谱和荧光分光光度法研究 AFs 的二级和三级结构转变。评估了 AFs 的粒径、分子量分布、表面疏水性和 zeta 电位。最后，测量了 AFs 系统的溶解度、乳化性能、起泡能力和粘度，以分析结构和形态演变对其功能特性的影响。本研究为小麦面筋的自组装行为和应用开发提供了理论基础。

章节片段
材料
含有 11.81% 蛋白质、1.5% 脂肪、0.50% 灰分、73.56% 碳水化合物和 12.64% 水分的小麦粉购自金源食品有限公司（郑州，中国）。牛胰蛋白酶（T819002, 2500U/mg）、ANS（纯度≥98%）和硫黄素 T (ThT)（D844310, 纯度≥95%）均购自麦克林（上海，中国）。所有试剂均为分析纯。

小麦面筋的提取
按照 Liang 等（2024）报道的方法提取小麦面筋，并进行了少量修改。小麦粉与...的混合物。

ThT 荧光强度
ThT 荧光强度
ThT 荧光强度是表征淀粉样纤维（AFs）的形成、含量和纤维化动力学的核心指标。其强度的变化直接反映纤维的数量和聚集程度。在不同条件下孵育期间面筋肽的 ThT 荧光强度变化和纤维生长曲线如图 1A 所示。随着孵育时间的增加，样品的荧光强度呈上升趋势。与...相比

结论
在水热孵育过程中，过程的温度和时间共同驱动水解面筋肽自组装成 AFs。升高的温度显著加速蛋白纤维形成的速率，其结构和微观形态随孵育时间有规律地演变。这些变化对于调节 AFs 的功能特性至关重要。图 8 总结了结构和形态的演变以及功能...

CRediT 作者贡献声明
王雨文：概念化，数据整理，形式分析，调查，方法论，软件，可视化，写作 - 初稿，写作 - 审阅与编辑。李梦圆：数据整理，形式分析，方法论，写作 - 审阅与编辑。王政：监督，验证，写作 - 审阅与编辑。张灵芳：验证，可视化，写作 - 初稿，写作 - 审阅与编辑。孙冰华：验证，可视化，写作 - 审阅与编辑。马森：

竞争利益声明
所有作者声明，在本手稿讨论的主题或材料中不存在利益冲突。

致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号 32272249）、河南省自然科学基金（编号 252300421032）以及河南工业大学食品工程技术研究中心/河南省重点实验室（编号 GO202603）的支持。

王雨文 | 李梦圆 | 王政 | 张灵芳 | 孙冰华 | 马森
河南工业大学食品科学与技术学院，郑州，450001，中国