超声处理对不同变性状态植物蛋白结构与凝胶化的影响

《Food Hydrocolloids》：Effects of Ultrasonication on Structure and Gelation of Plant Proteins at Different Denaturation States

　　

改变植物蛋白的功能性可提高其在食品配方中的应用性。在本研究中，研究人员探究了超声（US；20 kHz，1 h，2250 J/cm³）作为一种物理改性技术对蚕豆蛋白分离物（FB，富含豆球蛋白）和绿豆蛋白分离物（MB，富含豌豆球蛋白）的影响。蛋白质在不同热状态下处理，包括70 °C处理和90 °C处理，并评估了由此产生的结构变化（SDS-PAGE、尺寸排阻色谱（SEC）、圆二色光谱（CD）、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、差示扫描量热法（DSC）、粒径和热诱导凝胶化/流变学特性）。超声处理在不引起蛋白质降解的情况下减小了粒径，但诱导了可溶性蛋白部分的部分展开，改变了分子间相互作用，并降低了变性焓。尽管超声处理后G′和G″最初降低，但随后的加热促进了可溶性蛋白部分更有效的结构重组，这可能有助于凝胶网络结构的恢复或增强，尤其是在90 °C处理的蚕豆蛋白中。总体而言，这些发现表明，超声处理通过促进部分展开和重组非共价聚集体来调节可溶性蛋白部分的结构，这些变化的程度取决于蛋白质组成和先前的热状态。

**论文解读：超声处理对不同变性状态植物蛋白结构与凝胶化的调控机制**

**研究背景与问题**

植物蛋白作为可持续的动物蛋白替代品，在结构化食品体系中应用日益广泛。豆类蛋白的凝胶化行为强烈依赖于蛋白质浓度以及豌豆球蛋白型和豆球蛋白型球蛋白的相对比例。蚕豆和绿豆分离蛋白主要由贮藏球蛋白组成，其中蚕豆蛋白分离物富含豆球蛋白（11S球蛋白），而绿豆蛋白分离物以豌豆球蛋白（7S球蛋白）为主。结构上，豆球蛋白是由二硫键连接的酸性亚基和碱性亚基组成的六聚体蛋白（350-400 kDa），结构更紧凑且热稳定性更高；而豌豆球蛋白是缺乏链间二硫键的三聚体球蛋白（150-180 kDa），结构更灵活且表面活性更强，在加工过程中更容易聚集。以往研究表明，豆球蛋白通常有助于形成更强、更弹性的凝胶，而豌豆球蛋白则与更弱、更易聚集的结构相关。

热处理是植物蛋白基食品制造中的关键步骤。根据组成和热历史的不同，蛋白质可能保持天然状态、部分变性或形成不可逆聚集体，导致分子结构和凝胶化行为的显著差异。然而，过度变性和聚集可能降低溶解度、损害分子灵活性或改变凝胶化行为。因此，能够在热处理后进一步调整蛋白质结构的互补加工技术日益受到关注。其中，超声处理作为一种有效的物理改性技术，通过诱导空化驱动的剪切力和湍流，可减小粒径、促进部分展开并改变非共价相互作用，从而改变溶解度、聚集行为和凝胶化性能。然而，现有研究主要集中于超声参数对天然或未处理蛋白分离物的影响，尤其关注提取效率、溶解度和界面性质，对于超声如何影响已经历热处理的蛋白质关注较少。由于热处理改变了蛋白质构象和聚集状态，不同热状态的蛋白质对超声的响应预期不同，从而产生不同的结构和功能特性。尽管如此，超声对热诱导凝胶化途径的影响仍未被充分理解。

**研究目的与内容**

为解决上述问题，本研究探究了超声处理（20 kHz，1 h）对经不同预热处理（70 °C和90 °C）的蚕豆（富含豆球蛋白）和绿豆（富含豌豆球蛋白）蛋白分离物的影响。选择这两个温度是为了比较超声处理在豌豆球蛋白结构重排起始（70 °C）和豆球蛋白结构重排起始（90 °C）时的效果。研究人员采用综合多尺度方法，包括SDS-PAGE、SEC、CD、FTIR、DSC、粒径分析和流变学，以阐明结构演变和凝胶化行为。目的是阐明蛋白质组成和预热状态如何控制超声诱导的结构修饰，并建立其与热诱导凝胶网络形成的关系。理解这些机制为在热处理和结构化食品体系中定制植物蛋白功能性提供了基础。该论文发表在《Food Hydrocolloids》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）使用快速粘度分析仪（RVA）制备不同热状态（70 °C和90 °C）的蛋白质样品；2）采用探头式超声仪（20 kHz，50%振幅，脉冲模式，能量密度2250 J/cm³）进行超声处理；3）利用马尔文激光粒度仪（Malvern Mastersizer 2000）测定粒径分布；4）通过SDS-PAGE（非还原和还原条件）分析蛋白质分子量分布；5）使用?KTA Pure色谱系统配备Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进行尺寸排阻色谱（SEC）分析；6）利用Jasco J-810圆二色光谱仪（CD）和Perkin Elmer Spectrum Two FT-IR傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）分析二级结构；7）使用差示扫描量热仪（DSC Q2000）评估热性质；8）采用ARES-G2流变仪（50 mm平行板）进行频率扫描和温度扫描流变学测量。蛋白质样品来源：蚕豆蛋白分离物（FABRPRO03，蛋白>87%）和绿豆蛋白分离物（MUBNPR01，蛋白>85%）购自Australian Plant Protein。

**研究结果**

**3.1 粒径分布：** 通过静态光散射测定，超声处理减少了70 °C和90 °C处理样品的粒径。对于70 °C样品，超声增加了小颗粒（0.04-1 μm）比例，D[3,2]、d(0.1)和d(0.5)显著降低。对于90 °C样品，超声使分布左移且更对称，D[4,3]、d(0.5)和d(0.9)显著降低。绿豆蛋白（富含豌豆球蛋白）在70 °C下对超声更敏感，表现为更多小颗粒生成，而蚕豆蛋白（富含豆球蛋白）因二硫键稳定作用对超声响应较弱。

**3.2 分子表征：** SDS-PAGE显示，超声处理未改变蛋白质分子量分布或诱导降解，但增加了条带强度，表明可溶性聚集体解离。SEC分析表明，无论预热状态如何，超声处理均增加了可溶性聚集体的峰强度和面积，而低分子量组分基本不变，说明超声主要破坏弱结合的微米级聚集体，提高可溶性蛋白的分散性和可检测性。

**3.3 二级结构：** CD光谱显示，所有样品以无序结构（46.20-50.00%）和β-折叠（36.60-39.80%）为主，α-螺旋含量可忽略。超声处理后信号强度增加，表明蛋白质溶解增强和发色基团暴露，但二级结构组成变化微小。FTIR分析进一步证实，对于70 °C样品，超声引起最小结构变化；而对于90 °C样品，超声降低了β-折叠含量并增加了β-转角，表明超声可部分逆转或减轻热诱导的二级结构变化，尤其在β-折叠和β-转角方面。

**3.4 蛋白质构象：** 分子相互作用分析表明，超声处理增强了亲水、静电和非共价相互作用，但共价相互作用变化有限。蚕豆蛋白在90 °C下超声后相互作用增强最显著，顺序为FB-70-US < MB-70-US < FB-90-US < MB-90-US。巯基（SH）基团含量测定显示，FB-90-US、MB-70-US和MB-90-US的游离和总SH含量增加，表明蛋白质展开暴露了埋藏的SH基团；而FB-70-US的SH含量降低，可能归因于SH氧化为二硫键或再聚集。

**3.5 热性质：** DSC分析表明，超声处理降低了70 °C样品的变性焓（ΔH），从5.78降至4.58 J/g（FB-70-US）和从2.40降至2.04 J/g（MB-70-US），而转变温度（To、Tp、Tc）变化不大。对于90 °C样品，前处理后已发生不可逆变性和聚集，因此未检测到热转变。超声处理主要诱导部分展开，降低变性焓，但不显著影响转变温度。

**3.6 流变学性质：** 频率扫描显示，蚕豆蛋白体系在1-100 rad/s范围内G′始终高于G″，呈现弹性主导行为；超声处理后G′和G″均降低，尤其FB-90-US更明显。绿豆蛋白体系表现为G″ > G′，呈粘性主导；超声进一步降低模量，使体系更趋于流体。温度扫描表明，超声处理提高了绿豆蛋白的凝胶化温度（Tgel）（MB-70: 36.23→43.30 °C；MB-90: 36.43→47.49 °C），并延迟了凝胶化；对于蚕豆蛋白，FB-70-US的Tgel无显著变化，而FB-90-US初始模量降低一个数量级，但随后加热和冷却后最终凝胶模量与未超声样品相当或更高，表明超声诱导的部分展开和疏水/巯基基团暴露促进了后续加热中的蛋白质-蛋白质相互作用，恢复了凝胶网络形成。

**3.7 蛋白质结构与超声处理的相关性：** 层次聚类热图显示，FB-70、FB-70-US和MB-70聚为一类，具有较高的To、Tp、Tc和d(0.9)；MB-90-US、FB-90-US和MB-70-US形成另一类，具有较高的水、PBS、尿素和DTT可溶性蛋白分数以及较高的Tgel，但较低的To、Tp、Tc和d(0.9)，表明超声和预热处理后蛋白质展开增强、热稳定性降低。FB-90和MB-90因热诱导聚集具有较高的D[4,3]和d(0.9)。变量聚类表明，热稳定性与粒径聚集体密切相关，而粒径分布与非共价相互作用相关，水溶性和PBS可溶性分数与Tgel聚类，表明蛋白质水合和可溶性相互作用与凝胶化行为密切相关。

**讨论与结论**

**讨论部分（总结）：** 研究结果表明，超声处理以组成和状态依赖的方式调节蛋白质凝胶化，由蛋白质类型、先前热历史和构象状态共同决定。预热处理强烈决定了蛋白质的敏感性：70 °C时，豌豆球蛋白和豆球蛋白基本保持天然结构；90 °C时，豌豆球蛋白主要变性而豆球蛋白部分保持完整，这增加了豆球蛋白的相对贡献，形成更硬、更弹性的凝胶网络。超声处理减小了粒径并削弱了初始蛋白质-蛋白质关联，导致早期加热阶段G′和G″降低。然而，超声诱导的可溶性蛋白部分部分展开，增加了亲水和带电基团的暴露，增强了蛋白质-水相互作用，并伴随有限的共价交联和微小的二级结构变化，可能促进了后续加热和冷却过程中的网络重排，从而形成可比或更强的凝胶。对于富含豆球蛋白的体系，超声未改变70 °C处理状态的Tgel，而90 °C处理状态表现出初始软化阶段，可能有利于需要改善物料流动的加工操作（如混合、模塑、挤压）。对于富含豌豆球蛋白的体系，超声延迟了凝胶化并提高了G′/G″转变温度，可能通过延长凝胶形成前的流体状态来改善加工性。尽管存在加热过程中的差异，所有超声样品在冷却后形成可比或更强的凝胶，表明超声可定制加工行为而不损害最终质地。

**结论部分翻译：** 本研究证明，超声处理调节植物蛋白结构重排，其效果受蛋白质理化特性（蚕豆 vs. 绿豆）和预热处理（70 °C和90 °C）控制。超声处理减小了粒径并削弱了初始重构阶段的粘弹性响应，表明初始蛋白质网络被破坏。然而，超声诱导的可溶性蛋白部分展开，连同增加的蛋白质-水和静电相互作用、有限的共价交联以及微小的二级结构变化，可能促进了后续加热和冷却过程中的网络重排，导致可比或改善的凝胶形成，尤其是在90 °C处理的超声蚕豆蛋白中。此外，超声处理的蚕豆蛋白（富含豆球蛋白）在70 °C处理状态下保持一致的凝胶化温度，而90 °C处理状态表现出初始软化阶段，可能改善加工性。相比之下，两种热状态下的超声绿豆蛋白（富含豌豆球蛋白）均表现出延迟的结构重排和延长的流体行为，可能改善混合、挤压和成型过程中的过程控制。总体而言，超声处理提供了一种实用方法，可在维持或改善植物基工业食品凝胶化性能的同时定制加工性能。