硫醇-烯点击反应衍生的多孔层开管柱用于在线纯化和多重LC-MS/MS分析神经递质

《Analytical Chemistry》：Thiol–Ene Click-Derived Porous-Layer Open-Tubular Column for Online Purification and Multiplex LC–MS/MS Analysis of Neurotransmitters

　　

研究人员开发了一种基于硫醇-烯的多孔固定相（PLOT型涂层）用于在线样品净化和富集，并耦合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），用于同时测定生物基质中结构多样的神经递质。所得多孔硫醇-烯功能化毛细管柱结合了开管结构固有的高渗透性和定制化表面功能，使得无需衍生化即可直接注射并高效处理高极性、低丰度分析物。该方法允许在简化的分析工作流程中多重定量血浆、细胞样本和脑组织中的5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）和还原型谷胱甘肽（GSH）。与传统的离线方案相比，所提出的方法最大限度地减少了样品制备，同时保持高灵敏度和重现性，回收率在86%至100%之间，基质效应在90-104%范围内。该平台在不同生物基质中表现出可靠的分析性能，并与常规LC-MS/MS仪器兼容。总体而言，这项工作确立了硫醇-烯多孔毛细管作为生物分析中集成样品处理的可行策略，并将其应用扩展到复杂系统中极性代谢物图谱分析。

**论文解读：基于硫醇-烯点击化学的多孔层开管柱用于神经递质在线净化与多重LC-MS/MS分析**

**研究背景与问题**
神经递质（如5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和还原型谷胱甘肽）在细胞信号传导和氧化还原调节中起关键作用，其定量分析对生理、药理及临床研究具有重要意义。然而，由于这些分析物内源性浓度极低（血浆中常为ng mL^?1或pg mL^?1水平）、极性高，且生物基质（血浆、细胞、脑组织）复杂，传统的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法通常需要多步样品前处理，包括蛋白沉淀、溶剂萃取和衍生化。这些离线步骤不仅延长分析时间、降低通量，还可能引入变异性和分析物损失。尽管多孔层开管柱（PLOT）因其高渗透性、低背压和快速传质在气相色谱、毛细管电色谱和液相色谱中已有应用，但此前基于硫醇-烯点击化学的PLOT柱仅用于离线富集，尚未实现与LC-MS/MS的在线联用。因此，开发一种无需衍生化、可在线净化与富集、且能同时测定多种极性神经递质的方法，成为亟待解决的课题。

**研究内容与结论**
研究人员在《Analytical Chemistry》上发表的工作中，设计并合成了一种基于硫醇-烯点击化学的多孔层开管柱（TE-PLOT），并将其集成到在线管内固相微萃取（IT-SPME）系统中，与超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）联用，实现了对血浆、HEK-293细胞和小鼠脑组织中5种神经递质（5-HT、DA、Glu、GSH、GABA）的无需衍生化、多重定量分析。该方法回收率86–100%，基质效应90–104%，线性范围覆盖不同基质内源性浓度，日内和日间精密度（相对标准偏差RSD）均低于15%，符合美国食品药品监督管理局（FDA）生物分析方法验证指南。TE-PLOT柱可重复使用250次，储存12个月后性能无显著下降，表明其具有优异的稳定性和耐用性。该研究首次将硫醇-烯PLOT柱用于在线样品前处理，显著简化了工作流程，为复杂生物基质中极性代谢物的分析提供了一种高效、自动化的替代方案。

**主要关键技术方法**
1. **硫醇-烯点击化学合成多孔层开管柱**：以PEEK-sil毛细管为基底，经硅烷化引入双键，再通过N,N′-亚甲基双丙烯酰胺与季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)的点击聚合反应，在管壁内形成共价锚定的多孔聚合物涂层，并以二甘醇二乙醚和聚乙二醇为致孔剂调控形态。
2. **在线管内固相微萃取（IT-SPME）系统**：将TE-PLOT柱嵌入六通切换阀，实现样品加载、洗涤和洗脱的全自动化，与UHPLC-MS/MS直接耦合。
3. **UHPLC-MS/MS分析**：采用Luna Polar Pesticide分析柱，以含0.1%甲酸的水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，正离子加热电喷雾电离（HESI）源，三重四极杆质谱多反应监测（SRM）模式定量。样本来源：人血浆（5名健康志愿者，经知情同意）、小鼠脑组织（C57BL/6，购自Innovative Research, Inc.）和HEK-293细胞（ATCC）。

**研究结果**
- **Column Preparation and Characterization**：通过优化硫醇与烯烃单体的摩尔比（2:1），成功制备了机械稳定、多孔且具有高密度可及作用位点的TE-PLOT柱。扫描电镜（SEM）显示聚合物涂层均匀附着于管内壁，厚度约50 μm，表面呈微球状粗糙纹理；能量色散X射线光谱（EDX）证实硫元素存在于涂层中，表明点击反应成功；傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示巯基（S–H）峰消失，证明聚合完全。流体力学测量表明，在0.15 mL min^?1流速下压降仅5.45 bar，有效水力半径36.1 μm，水力渗透率1.63 × 10^?10 m²，流动孔隙率1.86%，几何表面积0.340 cm²，证实其兼具高渗透性和多孔层结构。
- **Optimization of the Online Loading Method**：系统考察了加载溶剂组成、乙腈含量、NH₄OH浓度及流速对吸附效率的影响。结果表明，在50%乙腈/水（含0.05% NH₄OH）条件下，分析物回收率最高（>90%）。吸附机制主要为亲水相互作用色谱（HILIC）样保留，辅以氢键、偶极-偶极和静电作用。洗脱采用含0.1%甲酸的乙腈/水梯度，通过降低有机相比例破坏亲水分配，实现高效解吸。
- **Column Stability, Reusability, and Storage Performance**：TE-PLOT柱在pH≈10（加载）和pH≈3（洗脱）条件下连续冲洗2 h后回收率仍接近100%；重复使用250次后性能无下降；室温避光储存12个月后回收率稳定，表明化学稳定性优异。
- **Adsorption Studies**：以5-HT和GSH为代表，利用Langmuir、Freundlich和Scatchard模型拟合吸附等温线。Langmuir模型拟合更优（R² 0.98和0.97），表明吸附为单分子层机制，最大吸附量约500 ng cm^?1。5-HT的Freundlich拟合（R² 0.92）提示其芳香结构可能引入二次非均相作用。
- **Validation Results**：在血浆、细胞和脑组织基质中分别验证线性范围、回收率、基质效应、精密度和检测限。血浆中除Glu和DA外，线性范围为2.5–100 ng mL^?1；细胞中为158–10000 pmol per 10⁶ cells；脑组织中为0.03–1.3 μg g^?1。所有基质回收率86–100%，基质效应90–104%，RSD<15%。直接进样（无IT-SPME）无法可靠检测血浆中低丰度神经递质，而加入TE-PLOT柱后实现定量。
- **Analysis of the Real Samples**：成功应用于人血浆、HEK-293细胞和小鼠脑组织。HEK-293细胞仅检测到Glu和GSH，符合其非神经元特性；脑组织浓度与文献报道一致；血浆浓度在代谢组学临床研究范围内。
- **Comparative Analysis with Other Methods**：与已报道方法相比，本方法仅需50 μL血浆，无需衍生化，总分析时间20 min，回收率和基质效应优于多数离线方法，尤其优于需衍生化（>60 min）或柱切换（回收率65–70%）的体系。
- **Untargeted HRMS Analysis**：通过非靶向高分辨质谱（HRMS）分析，从血浆中注释出60种化合物，涵盖酰基肉碱、氨基酸/肽、碳水化合物/有机酸和脂类等，表明TE-PLOT柱对极性和两性分子具有广泛提取能力，有望用于非靶向代谢组学。

**总结与讨论**
该研究成功开发了一种基于硫醇-烯点击化学的多孔层开管柱，作为在线样品前处理工具，与LC-MS/MS联用，实现了对极性神经递质的无需衍生化、多重定量分析。平台集样品净化和富集于一步，显著简化了工作流程，在血浆、细胞和脑组织等多种生物基质中表现出可靠的分析性能。TE-PLOT柱的高渗透性、多功能表面化学和优异稳定性，使其适合重复使用和长期储存。该方法不仅为神经递质分析提供了实用替代方案，还可扩展至其他极性小分子代谢物的分析，为非靶向代谢组学和外暴露组学提供了潜在工具。研究结论部分原文翻译如下：
“一种硫醇-烯多孔层开管柱被成功实现为用于极性神经递质LC-MS/MS分析的在线样品制备工具。所开发的平台通过将净化和富集合为一步，实现了直接、无需衍生化的分析，降低了与传统工作流程相比的操作复杂性。该方法在多种生物基质中表现出稳健的分析性能，回收率在86%至100%之间，基质效应维持在90-104%范围内，证实了基质干扰的有效缓解。管内固相微萃取（SPME）步骤的引入对于实现血浆中低丰度神经递质的可靠检测至关重要，而直接进样则不可行。多孔层涂层的高渗透性和多功能表面化学等物理化学性质，支持与低分子量极性分析物的高效相互作用，同时保持多次分析循环中的操作稳定性。这些结果证明了硫醇-烯PLOT柱在简化生物分析应用中的潜力。所提出的策略为神经递质分析的传统样品前处理方法提供了实用替代，并可扩展至其他需要最少样品处理的小极性代谢物类别。”