《Cell》：DDIAS shields single-stranded DNA in mitosis and promotes vertebrate brain development
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DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）和未解决的DNA复制中间产物在有丝分裂期间尤其危险。矛盾的是，细胞在染色体分离过程中会失活经典的DNA修复机制，转而依赖依赖于TOPBP1和CIP2A的替代途径，但这些途径的功能机制
DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）和未解决的DNA复制中间产物在有丝分裂期间尤其危险。矛盾的是，细胞在染色体分离过程中会失活经典的DNA修复机制，转而依赖依赖于TOPBP1和CIP2A的替代途径，但这些途径的功能机制仍不清楚。在此，研究人员描述了将DDIAS鉴定为一种有丝分裂特异性DNA损伤反应蛋白。研究人员确定DDIAS是TOPBP1-CIP2A复合物的磷酸化依赖性组分和效应分子，并证明DDIAS保护单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）免受异常的核酸酶加工处理，以在有丝分裂期间维护染色体完整性，特别是在BRCA1-/BRCA2-缺陷细胞中。研究人员还在患有严重神经发育障碍的患者中鉴定出DDIAS的双等位基因失活突变，并利用人类大脑类器官和斑马鱼证明，DDIAS在限制神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）的DNA损伤方面发挥着关键且进化上保守的作用。这些发现证明了有丝分裂期DNA损伤反应在脊椎动物神经发育过程中的生理作用。
**论文解读：DDIAS在有丝分裂中保护单链DNA并促进脊椎动物大脑发育**
**一、研究背景与问题**
基因组稳定性的维持对于所有生物体避免细胞死亡和疾病至关重要。罕见的遗传性染色体不稳定综合征，如Bloom综合征、范可尼贫血和Nijmegen断裂综合征，其特征包括小头畸形、免疫缺陷、癌症易感性增加等，凸显了基因组维护的重要性。细胞进化出广泛的DNA损伤反应网络，在间期检测并协调修复DNA损伤，并可触发检查点激活和细胞周期阻滞，确保细胞不会带着断裂的染色体进入有丝分裂。然而，有丝分裂对基因组维护提出了独特的挑战：一旦细胞进入分裂，DNA损伤检查点和大多数DNA修复途径会被失活。尽管如此，细胞确实会启动一种有丝分裂特异性DNA损伤反应，该反应对于防止染色体错误分离和微核形成至关重要。在此过程中，MDC1招募包含TOPBP1和CIP2A的复合物到DNA双链断裂（DSBs）处，TOPBP1形成可以桥接离散MDC1病灶的丝状结构，提示该复合物通过束缚断裂的染色体片段来维持染色体完整性。然而，TOPBP1和CIP2A均不含已知的DNA结合结构域，提示至少存在一个额外因子将它们连接到DNA损伤位点。此外，调控该途径组装的机制尚不清楚，且尚无遗传病被明确关联到异常的有丝分裂DNA损伤反应。因此，探究TOPBP1-CIP2A途径的功能机制及其在人类生理和疾病中的作用非常重要。
**二、研究内容与意义**
研究人员在两名表现为染色体不稳定综合征样临床特征的患者中，鉴定出DDIAS基因的双等位基因失活突变。通过一系列细胞生物学和生物化学实验，研究人员揭示了DDIAS是有丝分裂TOPBP1-CIP2A复合物的第三个核心组分，利用其单链DNA（ssDNA）结合结构域保护DNA损伤位点免受异常核酸酶加工，特别是在BRCA缺陷细胞中。此外，利用斑马鱼、人类大脑类器官和诱导多能干细胞（iPSCs）来源的神经祖细胞（NPCs），研究人员证明了DDIAS在神经发育过程中限制DNA损伤方面发挥着关键且进化上保守的作用。该研究首次将异常的 mitotic DNA损伤反应与人类遗传病联系起来，揭示了神经祖细胞对有丝分裂期基因组维护途径的独特依赖性，为理解小头畸形的发病机制提供了新视角。该成果发表在《Cell》杂志。
**三、关键技术与方法**
研究人员使用了多种关键技术：首先，对来自巴基斯坦近亲婚配家庭的患病个体进行全外显子测序（WES），鉴定出DDIAS基因的纯合无义突变（c.1631C>A; p.Ser544Ter）。其次，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建DDIAS敲除的DLD-1、RPE-1和iPSC细胞系，并通过慢病毒转导建立诱导型HaloTag融合DDIAS表达系统。第三，采用定量图像细胞术（QIBC）、Airyscan超分辨共聚焦显微镜和免疫荧光分析检测蛋白定位和病灶形成。第四，通过生物素化肽段pull-down结合定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定DDIAS相互作用蛋白和磷酸化位点，并运用AlphaFold 3进行结构预测。此外，还使用了电泳迁移率变动实验（EMSA）、荧光偏振、免疫沉淀、菌落存活实验、斑马鱼CRISPR-Cas9 F0突变体（crispants）模型和人脑类器官培养等技术。
**四、研究结果**
**1. DDIAS在具有基因组不稳定综合征症状的神经发育障碍中发生突变**
通过对一个近亲婚配家庭两名患病男童进行WES，研究人员鉴定出DDIAS基因的纯合无义突变（p.Ser544Ter）。患者来源的淋巴母细胞表现出染色体畸变和微核增加，外源性表达野生型DDIAS可恢复至对照水平，证实该突变是致病原因。
**2. DDIAS是一种有丝分裂DNA损伤反应蛋白**
在间期，DDIAS呈全核分布，但在基因毒性应激下的有丝分裂细胞中，DDIAS形成与γH2AX共定位的病灶。DDIAS的招募依赖于CIP2A和TOPBP1，且DDIAS与TOPBP1在丝状结构中共定位，表明其作用于TOPBP1-CIP2A下游。
**3. DDIAS招募至有丝分裂DNA损伤位点的机制**
AlphaFold预测DDIAS除N端寡核苷酸结合（OB）折叠域外大部分无序。患者突变S544X破坏DDIAS病灶形成，而缺OB折叠不影响定位，表明C端序列介导其招募。通过肽段pull-down和质谱分析，研究人员发现TOPBP1通过其BRCT结构域直接结合DDIAS的pSer676、pThr868和pSer993磷酸化位点，而PLK1结合pThr775。
**4. CDK1和PLK1促进DDIAS与TOPBP1结合**
DDIAS与TOPBP1的相互作用依赖于CDK1和PLK1激酶活性。CDK1直接磷酸化Ser993并间接通过磷酸化Thr775产生PLK1对接位点；PLK1结合后可能进一步磷酸化Ser676和/或Thr868，从而建立稳定、高亲和力的DDIAS-TOPBP1相互作用。
**5. DDIAS的OB折叠结构域结合ssDNA**
重组DDIAS OB折叠域在体外能结合ssDNA，但不能结合双链DNA（dsDNA）。预测参与锌指基序的半胱氨酸突变（C25A/C28A）消除ssDNA结合，表明该OB域以类似RPA1的方式结合ssDNA。
**6. DDIAS抑制无着丝粒微核形成，且其缺失与BRCA1/BRCA2缺陷具有协同致死效应**
DDIAS缺失导致无着丝粒微核增加，回补野生型DDIAS可抑制该表型，而丧失TOPBP1结合、PLK1结合、ssDNA结合或患者S544X突变体均不能。在BRCA1或BRCA2缺陷背景下，DDIAS缺失显著诱导微核并降低细胞存活率，表明其是HR缺陷细胞生存所必需的下游因子。
**7. DDIAS不促进MiDAS、DNA末端束缚或有丝分裂DSB修复**
与CIP2A不同，DDIAS缺失对早期有丝分裂细胞的EdU病灶数量、染色体破碎后的γH2AX病灶分布以及POLQ抑制下的γH2AX消散均无显著影响，提示DDIAS的功能并非参与这些已知途径。
**8. DNA2抑制可降低DDIAS缺陷细胞的无着丝粒微核**
DDIAS缺失导致有丝分裂细胞RPA2病灶积累，且回补野生型DDIAS可抑制，而OB缺失或ssDNA结合缺陷突变不能。小规模siRNA筛选和DNA2抑制剂C5处理实验证实，DNA2核酸酶介导了DDIAS缺陷细胞中微核的形成，表明DDIAS保护ssDNA免受DNA2等酶的毒性加工。
**9. DDIAS缺陷导致斑马鱼小头畸形样表型和神经回路功能障碍**
在斑马鱼中敲除ddias基因导致脑区面积减小，颅面软骨发育异常，并增加癫痫易感性。这些表型可通过表达人野生型DDIAS rescued，而S544X和3A（丧失TOPBP1结合）突变体不能，表明DDIAS在脊椎动物神经发育中具有进化保守作用。
**10. DDIAS功能缺失在人脑类器官中导致小头畸形样表型**
利用CRISPR-Cas9敲除DDIAS的iPSCs生成人脑类器官，虽然类器官结构分层无明显差异，但DDIAS缺陷类器官显著变小，且SOX2阳性神经祖细胞（NPCs）中γH2AX水平显著升高，而TBR1阳性神经元中未见。
**11. DDIAS限制神经干细胞中的染色体不稳定性**
WT和ΔDDIAS iPSCs分化来源的iNPCs中，DDIAS缺陷iNPCs表现出显著升高的微核形成和有丝分裂期RPA2病灶积累。这种自发性染色体不稳定性仅出现在NPCs中，而iPSCs、患者成纤维细胞和DLD-1癌细胞需要外源基因毒性应激或BRCA缺陷才能显示表型，揭示了NPCs对DDIAS功能缺失的独特脆弱性。
**五、讨论与结论**
该研究表明，DDIAS作为TOPBP1-CIP2A复合物的组分，通过其N端OB折叠为复合物提供ssDNA结合活性，以CDK1和PLK1激酶依赖的方式在有丝分裂中保护ssDNA免受异常核酸酶加工。研究人员提出，在间期细胞中，RAD51可防止DNA2等酶对ssDNA的异常核酸酶消化，但在有丝分裂中RAD51加载被抑制，DDIAS可能发挥类似的功能。研究还证实，破坏TOPBP1-CIP2A介导的 mitotic DNA损伤反应会导致人类发育障碍。NPCs对DDIAS缺失的选择性脆弱性可能是由于它们频繁进入有丝分裂时携带未复制区域和DNA断裂，高度依赖该途径维持染色体稳定。该研究将mitotic DNA损伤反应与人类神经发育疾病联系起来，为小头畸形的分子机制提供了新见解。研究也存在局限性，如DDIAS与RPA、DNA2的精确分子关系尚未明确，DDIAS在Ser676和Thr868磷酸化检测存在技术困难，TOPBP1、CIP2A和DDIAS的寡聚化状态未知，且人类DDIAS缺陷的临床谱系仅来源于一个近亲婚配家庭，需要更多病例验证。
