肥胖相关的代谢性炎症改变了哥廷根迷你猪的甲型流感抗病毒反应

《iScience》：Obesity-associated meta-inflammation alters influenza A antiviral responses in G?ttingen minipigs

　　

亮点
•饮食诱导的肥胖损害了迷你猪体内甲型流感病毒的清除
•肥胖猪表现出改变的抗病毒和干扰素刺激反应
•流感在肥胖状态下诱导了增加的上呼吸道和全身炎症
•肥胖的哥廷根迷你猪支持流感转化研究

摘要
肥胖是公认的甲型流感病毒 (IAV) 感染后病情加重风险增加的因素，这可能是因为促进了代谢性炎症和免疫失调，但其对抗病毒和炎症反应的影响仍知之甚少。使用饮食诱导肥胖的哥廷根迷你猪模型，我们比较了 IAV 感染前后的抗病毒和炎症反应。呼吸道转录组学和组织病理学显示，未感染的迷你猪没有明显的与肥胖相关的免疫或炎症变化。相比之下，肥胖猪在感染后 4 天表现出鼻黏膜组织中病毒清除减少，并伴有抗病毒基因表达模式的改变。此外，观察到肥胖猪感染后呼吸道细胞浸润。最后，肥胖猪的 C 反应蛋白浓度显著增加，表明对呼吸道感染的全身炎症反应增强。这些发现表明，哥廷根迷你猪的饮食诱导肥胖与 IAV 感染后抗病毒和炎症反应改变有关，并支持肥胖迷你猪模型的转化价值。

图形摘要

引言
甲型流感病毒 (IAV) 构成持续的流行病威胁，代表了重大的全球健康挑战，每年导致 300 万至 500 万例严重疾病病例和多达 650,000 例死亡。生活在肥胖状态（BMI ≥ 30 kg/m2）的个体更容易患流感、COVID-19 等呼吸道疾病，且病情严重进展和住院的风险增加。随着肥胖在全球范围内达到流行比例，这代表着一个不断升级的公共卫生挑战。与肥胖相关的低度炎症状态——代谢性炎症，被认为在流感和 COVID-19 感染的不利结果中起着核心作用，尽管确切机制仍有待阐明。然而，理解这些机制对于定制抗病毒药物和疫苗以保护这一日益增长的高危人群至关重要。

对 IAV 感染的免疫反应涉及模式识别受体 (PRRs) 和下游效应物，如干扰素调节因子 7 (IRF7)，它们触发干扰素 (IFN) 的产生，随后诱导抗病毒干扰素刺激基因 (ISG) 和趋化因子表达，后者导致受累组织中的免疫细胞浸润。这些反应由炎症介质平衡，以控制病毒复制并最小化组织损伤。肥胖诱导的代谢性炎症可能会改变这些防御过程，导致抗病毒基因表达失调，并损害免疫细胞功能。这种免疫调节的破坏可能导致肥胖个体观察到的抗病毒反应减弱和更严重的疾病结果。这已在肥胖小鼠和水貂的研究中得到证明，这些研究显示病毒清除受损，I 型 IFN 反应延迟，免疫细胞功能受损，病情严重程度增加。

在此，我们采用哥廷根迷你猪作为大型动物模型，具有较高的转化有效性，用于研究 IAV 感染、肥胖和代谢性炎症。猪自然易感与人类相同的 IAV 亚型，并密切模拟人类临床表现、呼吸生理和免疫反应。此外，它们对饮食诱导的肥胖表现出相似的代谢和炎症反应，使它们成为理解肥胖背景下宿主 - 病原体相互作用的宝贵模型。

在本研究中，我们使用了先前描述的饮食诱导肥胖和代谢性炎症模型中的同一队列哥廷根迷你猪，其特征是炎症急性期蛋白 C 反应蛋白 (CRP) 长期增加，在为期 103 天的高脂、高果糖和高胆固醇 (HFFC) 饮食后超过 11 周。此外，我们显示肥胖猪发生了中性粒细胞增多，循环白细胞、内脏脂肪组织和肝脏中急性期蛋白和炎症细胞因子的基因表达增加。基于这一队列迷你猪，本研究检查了 IAV 感染前后鼻黏膜、上、下气管和肺部的抗病毒免疫反应。利用我们建立的与代谢性炎症相关的饮食诱导肥胖迷你猪模型，本研究旨在调查肥胖如何调节对 IAV 感染的抗病毒和炎症反应动态，从而在现有知识与临床相关的大型动物模型之间提供转化桥梁。

结果
肥胖与呼吸道组织中病毒载量增加相关
图 1 提供了实验设计的概述，包括感染组、采样时间点和组织分析。在呼吸道的四个不同部位评估病毒 RNA 载量：鼻黏膜、上气管、下气管和肺。在接种后 4 天 (dpi)，与瘦组 (lean-IAV) 相比，肥胖猪 (obese-IAV) 的鼻黏膜组织中发现显著更高水平的病毒 RNA (p = 0.02, 独立双样本 t 检验) (图 2)。肥胖-IAV 猪鼻黏膜组织中病毒 RNA 中位水平为 9.24 × 10^4 copies/mL，瘦-IAV 猪为 4.73 × 10^4 copies/mL。在上气管中，肥胖-IAV 组病毒 RNA 中位水平为 1.24 × 10^6 copies/mL，瘦-IAV 组为 3.36 × 10^5 copies/mL。在下气管中，病毒 RNA 中位水平分别为 5.92 × 10^5 和 6.96 × 10^4 copies/mL。虽然在上和下气管组织中，肥胖-IAV 组的病毒 RNA 中位水平均高于瘦-IAV 组，但这些差异无统计学意义 (图 2)。肥胖-IAV 和瘦-IAV 组在肺部表现出相似的中位数值，无显著差异。

图 1 实验设置
(A) 哥廷根迷你猪 (n = 26) 饲喂高脂、高果糖和高胆固醇 (HFFC) 饮食 (肥胖，n = 13) 或标准饮食 (SD) (瘦，n = 13) 103 天。在第 99 天，每个饮食组的猪要么接种 IAV (A/swine/Denmark/12687/2003) (肥胖-IAV, n = 9; 瘦-IAV, n = 9)，要么用无病毒的病毒生长培养基模拟接种 (肥胖-mock, n = 4; 瘦-mock, n = 4)。饮食期间的血清 C 反应蛋白数据 (红色：肥胖饮食；蓝色：瘦饮食) 已发表。蓝色方块表示本文研究中展示的部分。
(B) 用于研究局部抗病毒免疫反应的样本部位。由 BioRender.com 创建。

图 2 肥胖猪接种后 4 天上呼吸道病毒 RNA 载量增加
每只猪以点表示，颜色根据各自组别区分。黑线代表病毒载量中位数。所有模拟接种的猪流感检测均为阴性。n = 4 (瘦-mock), n = 4 (肥胖-mock), n = 9 (瘦-IAV), and n = 9 (肥胖-IAV) 独立动物。统计使用独立双样本 t 检验进行。?p < 0.05。

肥胖迷你猪中的病毒诱导炎症增强
与饲喂标准饮食的对照组相比，HFFC 14 周饮食方案在感染前诱导了肥胖和代谢性炎症。这由从第 3 周开始观察到的 CRP 显著增加所证明，达到约为健康雄性哥廷根迷你猪典型基线水平的 3-5 倍，随后从第 7 周开始体重和腹围显著增加。在 0 dpi 时，肥胖-IAV 组的血清 CRP 浓度为～45 mg/L，而瘦-IAV 组为～10 mg/L。4 dpi 时，肥胖-IAV 组的平均血清 CRP 浓度相对于肥胖-mock 对照显著增加了约 100 mg/L (p = 0.01, 混合 ANOVA 配合双侧 Welch's t 检验)。相比之下，瘦-IAV 组在 4 dpi 时增加了～25 mg/L，与其未感染对照组 (瘦-mock) 无显著差异。虽然瘦动物从第 0 天的相对增加更大，但瘦-IAV 组的 CRP 水平在 4 dpi 时与其未感染对照组无显著差异。相比之下，肥胖-IAV 组在感染后所有时间点（第 2 天除外）均显示出 CRP 显著增加。综合来看，这些发现表明肥胖猪对 IAV 感染的全身炎症反应增加 (图 3)。

图 3 肥胖猪对 IAV 感染的血清 C 反应蛋白反应增强
肥胖-IAV 组、瘦-IAV 组、肥胖-mock 组和瘦-mock 组的 CRP。均值±SEM。由于缺失样本，在两个时间点 (2 和 3 dpi) 排除了瘦-IAV 组的一只动物。n = 4 (瘦-mock), n = 4 (肥胖-mock), n = 9 (瘦-IAV), and n = 9 (肥胖-IAV) 独立动物。统计使用混合 ANOVA 随后进行双侧 Welch's t 检验，p 值使用 Benjamini-Hochberg 程序调整。?p ≤ 0.05 and ??p ≤ 0.01。

转录组分析揭示 IAV 感染后肥胖迷你猪下气管中固有免疫激活增强
由于肥胖-IAV 和瘦-IAV 之间病毒 RNA 载量的最大差异在 4 dpi 时在下气管观察到 (图 2)，选择呼吸道这一部位使用 RNA 测序 (RNA-seq) 进行全面基因表达谱分析。
在下气管中共识别出 493 个差异表达基因 (DEGs) (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)。其中，比较肥胖-mock 和瘦-mock 组时发现有 27 个 DEGs (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序) 差异表达，瘦-IAV 和瘦-mock 组之间共识别出 197 个 DEGs (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)。 (图 4A; 表 S1)。DEGs 数量最多的是肥胖-mock 和肥胖-IAV 组之间，共 292 个 (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)，其中 272 个 (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序) 与该比较独特相关 (图 4A)。

图 4 只有肥胖猪在甲型流感病毒感染后 4 天下气管组织中显示与固有抗病毒免疫相关的 KEGG 通路富集
(A) 文氏图说明了 IAV 感染后下气管中显著差异表达基因的分布。
(B 和 C) (B) 比较瘦-mock 与瘦-IAV 以及 (C) 肥胖-mock 与肥胖-IAV 的差异表达基因 (DEGs) 相关的生物学通路的 KEGG 富集分析。气泡图表示特定通路中富集的 DEGs 与识别的基因总数的比率。圆圈表示相应通路中的基因数量，颜色描绘 q 值。
(D) 选定的用于病毒感应和 IFN 通路调节剂及效应 ISG 的显著表达抗病毒基因的文氏图。n = 4 (瘦-mock), n = 4 (肥胖-mock), n = 9 (瘦-IAV), and n = 9 (肥胖-IAV) 独立动物。RNA-seq 数据已归一化，DEGs 使用 DESeq2 识别并使用 Benjamini-Hochberg 进行多重测试校正，DEGs 定义为 q 值 <0.05 且 fold changes 为±1.5。

京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 富集分析 lean-mock 和 lean-IAV 之间 4 dpi 的独特 DEGs 显示没有与病毒感染免疫反应相关的显著富集通路 (图 4B)，而 obese-mock 和 obese-IAV 之间 DEGs 的 KEGG 富集分析揭示了多个与 IAV 感染相关的显著富集通路，如“抗原加工和呈递”、“Toll 样受体信号通路”、“甲型流感”和"NOD 样受体信号通路” (图 4C)。几个涉及病毒感应和干扰素调节的基因，包括 Toll 样受体 7 (TLR7) (q = 0.03, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)、DExD/H-box 解旋酶 60 (DDX60) (q = 0.001, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序) 和几个 IRFs (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)，以及关键 ISGs 如干扰素诱导含四肽重复蛋白 (IFITs) (q ≤ 0.05, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序)、2′-5′-寡腺苷酸合成酶 2 (OAS2) (q = 0.04, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序) 和 OAS 样 (OASL) (q ≤ 0.01, DESeq2 配合 Benjamini-Hochberg 程序) 在 4 dpi 时的肥胖-IAV 组中显著上调 (图 4D)。RNA-seq 结果通过微流控 qPCR 得到证实，显示选定基因一致的基因表达模式 (图 S1)。基于 obese-mock 和 obese-IAV 之间的这些富集通路，选择了一个包含 24 个相关基因（包括参考基因）的面板，通过微流控 qPCR 在鼻黏膜、上气管和肺中定量，以研究多个呼吸部位对感染的固有抗病毒免疫反应 (表 S2)。

肥胖在未感染 IAV 的情况下引起呼吸道有限变化
在所有检查的呼吸道部分中，只有编码热休克蛋白 70-2 (HSP70-2) 的基因在细胞应激、炎症和代谢调节中起作用，在肥胖-mock 组的肺中与瘦-mock 组相比显著上调 (p = 0.03, Welch's t 检验) (表 S3)。

此外，进行了蛋白质组学分析以定量肺部的蛋白质水平，除了载脂蛋白 E (APOE) 外，感染前瘦型和肥胖型猪之间的蛋白质丰度没有显著差异（表 S4）。在肥胖型对照组（obese-mock）中，与瘦型对照组（lean-mock）相比，使用微流控 qPCR 检测的所有呼吸道组织中，几种先天抗病毒基因（包括 OAS2、信号转导与转录激活因子 1 (STAT1) 和 IRF7）表现出表达量略低的趋势，尽管这些差异不显著（表 S3）。上气管的组织病理学检查显示，瘦型或肥胖型对照组均未出现一致性的变化（图 5A1）。在瘦型对照组的一头猪和肥胖型对照组的一头猪中观察到了局灶性化生鳞状上皮（图 5A2）。瘦型对照组的肺部未观察到变化（数据未显示）。在肥胖型对照组中，一头猪表现出局灶性肺矿化（图 5B1），另一头肥胖型对照猪表现出肺巨噬细胞和中性粒细胞的肺泡浸润（图 5B2 和 5B3）。肥胖型对照组其余猪的肺部未观察到变化（数据未显示）。

图 5 瘦型和肥胖型模拟感染猪上气管和肺的组织病理学变化。猪上气管（A）和肺组织（B）苏木精 - 伊红（H&E）染色的代表性图像。上气管在瘦型对照组或肥胖型对照组中均未观察到一致的变化（A1），瘦型对照组的一头猪出现化生鳞状上皮（箭头所示）（A2）。肥胖型对照组的一头猪出现肺矿化（圆圈所示）（B1）。肥胖型对照组的一头猪肺泡巨噬细胞（箭头所示）腔内浸润增加，以及少量细支气管出现中性粒细胞（箭头所示）腔内浸润（B2 和 B3）。n = 4（瘦型对照），n = 4（肥胖型对照）个体动物。

肥胖与甲型流感病毒 (IAV) 感染后鼻黏膜和气管组织中干扰素刺激及免疫激活反应的变化有关。在感染后第 4 天 (4 dpi) 时，检查了鼻咽拭子样本、鼻黏膜组织、上气管和肺组织中参与干扰素刺激和抗病毒免疫激活的基因（图 6；图 S2；表 S5）。

图 6 感染后第 4 天 (4 dpi) 时肥胖猪鼻黏膜和上气管中参与病毒识别、免疫反应和炎症的基因表达增加。显示（A）鼻黏膜和（B）上气管的基因表达，倍性变化为±1.5。平均值±标准误。对照组设为 1；IAV 组根据其各自的对照组进行缩放（瘦型-IAV 相对于瘦型对照，肥胖型-IAV 相对于肥胖型对照）。n = 4（瘦型对照），n = 4（肥胖型对照），n = 9（瘦型-IAV），n = 9（肥胖型-IAV）个体动物。统计使用韦尔奇 t 检验完成。?p ≤ 0.05 和??p ≤ 0.01。

感染后，在感染前后每日采集的肥胖和瘦型动物的鼻咽拭子样本中均观察到经典的先天抗病毒免疫反应（图 S2）。几种模式识别受体 (PRRs) 和干扰素刺激基因 (ISGs) 在感染后表达增加，在感染后第 1 天和第 2 天 (1 和 2 dpi) 时检测到最高表达，随后在感染后第 4 天恢复到基线水平。两组饮食组之间未观察到差异（图 S2）。

在下层鼻黏膜组织中，与肥胖型对照组相比，肥胖型-IAV 组在感染后第 4 天时，几种 ISGs（包括鸟苷酸结合蛋白 1(GBP1)（p = 0.001，韦尔奇 t 检验）、OAS2（p = 0.04，韦尔奇 t 检验）、STAT1（p = 0.04，韦尔奇 t 检验））、抗原加工相关转运蛋白 1 (TAP1)（p = 0.05，韦尔奇 t 检验）和 TAP2（p = 0.04，韦尔奇 t 检验）的表达显著更高（图 6A）。此外，与肥胖型对照组相比，肥胖型-IAV 组中 IRF7（p = 0.03，韦尔奇 t 检验）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1 (CASP1)（p = 0.04，韦尔奇 t 检验）的表达也显著升高（图 6A）。相反，在瘦型-IAV 组中，只有 TAP1（p = 0.05，韦尔奇 t 检验）相对于瘦型对照组显著上调，尽管其他几个基因（CASP1、CXCL10、GBP1 和 TAP2）显示出表达升高的趋势，但不显著（图 6A）。

在上气管中，与肥胖型对照组相比，肥胖型-IAV 组中参与 I 型干扰素反应的基因，包括 GBP1（p = 0.01，韦尔奇 t 检验）、IRF7（p = 0.001，韦尔奇 t 检验）、STAT1（p = 0.01，韦尔奇 t 检验）、ISG12A（p = 0.002，韦尔奇 t 检验）、CXCL9（p = 0.01，韦尔奇 t 检验）和 CXCL10（p = 0.005，韦尔奇 t 检验），显著上调（图 6B）。此外，参与病毒识别和先天免疫的基因，如 TLR7（p = 0.05，韦尔奇 t 检验）、CASP1（p = 0.008，韦尔奇 t 检验）和分化簇 68 (CD68)（p = 0.04，韦尔奇 t 检验），也显示出显著上调。与凋亡和应激反应相关的基因，包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 10 (TNFSF10)（p = 0.02，韦尔奇 t 检验）、热休克蛋白家族 A (Hsp70) 成员 2 (HSP70-2)（p = 0.01，韦尔奇 t 检验）和 HSPA6（p = 0.02，韦尔奇 t 检验），在肥胖型-IAV 组中也同样显著升高。与鼻黏膜组织一致，在 IAV 感染后 4 天，瘦型-IAV 组的气管组织中只有少数抗病毒先天免疫基因被发现受调控。GBP1（p = 0.02，韦尔奇 t 检验）在瘦型-IAV 组中显著上调，而 HSP70-2 显示出边缘性上调。尽管瘦型-IAV 组中其他几个基因（例如，CD86、CXCL10、HSPA6、STAT1 和 TNFSF10）的表达水平略高于瘦型对照组，但这些差异不显著（图 6B）。

在肺组织中，与各自的对照组相比，在感染后第 4 天 (4 dpi) 时，肥胖型-IAV 或瘦型-IAV 组中均未发现基因显著受调控（表 S5）。

肥胖微型猪在 IAV 感染后气管和肺中观察到巨噬细胞浸润增加。采用苏木精 - 伊红（H&E）染色评估肥胖是否影响 IAV 感染后上气管和肺组织中的免疫细胞浸润。上气管的组织病理学评估显示，瘦型-IAV 组中四头猪中有两头出现纤毛丢失（图 7A1）。在肥胖型-IAV 组中，四头猪中有两头在 IAV 感染后显示上气管上皮空泡化且下黏膜层存在单核细胞，无纤毛丢失（图 7A2 和 7A3）。

图 7 IAV 感染后瘦型和肥胖型猪上气管和肺组织的组织病理学变化。上气管（A）和肺（B）苏木精 - 伊红（H&E）染色的代表性图像。（A1）瘦型-IAV 组气管纤毛丢失（箭头所示）。（A2 和 A3）气管上皮空泡化（箭头所示）以及下黏膜层单核细胞浸润（线所示）。（B1）细支气管中少量中性粒细胞渗出（箭头所示）。（B2 和 B3）肺中肺泡巨噬细胞数量增加（圆圈和箭头所示）。n = 9（瘦型-IAV），n = 9（肥胖型-IAV）个体动物。

对肺组织的检查显示，在瘦型-IAV 组的一头猪中，支气管和细支气管在感染后第 4 天 (4 dpi) 时有少量中性粒细胞渗出（图 7B1），在瘦型-IAV 组其余三头猪中未观察到变化（数据未显示）。在肥胖组中，四头肥胖猪中有三头在感染后第 4 天 (4 dpi) 时左心叶肺中显示存在肺泡巨噬细胞（图 7B2 和 7B3）。

讨论

本研究在一个哥廷根小型猪模型中检查了饮食诱导的肥胖如何影响上呼吸道和下呼吸道对 IAV 感染的先天抗病毒免疫反应。我们观察到与瘦型猪相比，肥胖型猪具有更强的抗病毒和炎症反应，以及对感染的系统性炎症反应增加。据我们所知，这是第一项研究，利用高度转化的大型动物模型来表征在肥胖和代谢性炎症存在下，IAV 感染期间先天抗病毒防御、炎症基因及相关通路的调控情况。

尽管存在肥胖和系统性炎症，但在模拟接种的肥胖动物呼吸道组织中未观察到炎症。与瘦型对照组猪相比，未感染的呼吸道组织中，肥胖型对照组中的抗病毒和炎症基因以及蛋白质表达模式基本不变，这与之前关于肥胖未感染小鼠和水貂呼吸道组织以及体外感染人呼吸道细胞的报道相反。这种差异可能是由小样本量（n = 4）、采样时间、哥廷根小型猪的物种和模型特异性反应，以及高脂饮食诱导的潜在不同炎症表型与其他饮食相比来解释的。然而，模拟组的转录组和蛋白质组数据是一致的，因为基因表达和蛋白质水平都表明基线炎症最小。基因和蛋白质数据之间的一致性表明，在小型猪模型中，肥胖本身在感染前并未在呼吸道中诱导可检测到的炎症。

与瘦型对照组和肥胖型对照组中炎症基因和蛋白质低表达一致，气管的组织病理学检查显示无可检测到的变化，仅在四头肥胖动物中有一头观察到免疫细胞的存在。相反，两项小鼠研究表明，肥胖与肺中中性粒细胞和巨噬细胞数量增加有关，从而增加了肺免疫细胞浸润。

检查的所有四个呼吸道组织部位在感染后第 4 天 (4 dpi) 时，肥胖组均显示更高的病毒 RNA 载量，尽管仅在鼻黏膜组织中显著。这些发现与之前在小鼠肺组织感染后第 3 天 (3 dpi) 和人鼻咽抽吸物中的研究相矛盾，那些研究中在感染后 24-48 小时未发现肥胖和瘦型个体之间病毒 RNA 载量有显著差异。然而，我们的结果与一项小鼠研究一致，该研究显示肥胖小鼠在感染后第 3 天和第 5 天 (3 和 5 dpi) 时病毒滴度更高。这些不同的发现可能突出了肥胖驱动的免疫改变的模型特异性差异、实验系统的差异以及采样时间点的不同。

在表征了病毒 RNA 水平后，我们接下来检查了感染后先天免疫激活的持续时间。在我们小组之前使用相同病毒株（A/swine/Denmark/12687/2003 [H1N2]）进行的一项猪感染研究中，我们表明病毒 RNA 和先天抗病毒免疫基因（包括 DExD/H-box 解旋酶 58 [DDX58]、TLR3、MX 动力蛋白像 GTP 酶 1 [MX1] 和 ISG15）的表达在感染后第 1 天 (1 dpi) 时达到峰值，在某些情况下，在杂交大白猪×德国陆支猪中，在感染后第 3 天 (3 dpi) 时已下降或恢复到基线水平。这种相对迅速的反应正常化与本研究中的瘦型-IAV 组一致，在该组中，只有少数基因在感染后第 4 天 (4 dpi) 时显著受调控。此外，在本研究中从鼻咽拭子样本分离的黏液中观察到相似的早期峰值（在感染后第 1 天和第 2 天之间）的先天抗病毒免疫基因。瘦型猪呼吸道组织中感染后第 4 天 (4 dpi) 时整体缺乏显著的经典型抗病毒先天免疫反应，很可能反映了在早期抗病毒峰值后免疫系统恢复到基线稳态，这与我们之前的发现一致。

相反，肥胖猪的 IAV 感染导致在感染后第 4 天 (4 dpi) 时仍保持更明显的抗病毒反应，在鼻黏膜和气管组织中先天抗病毒基因（例如，OAS2、IRF7、STAT1、TAP1 和 TAP2）表达增加。KEGG 通路分析支持这一观察，揭示了在感染后第 4 天 (4 dpi) 时富集了几个抗病毒和免疫相关通路，包括抗原加工、Toll 样受体信号传导和甲型流感等通路。感染后第 4 天 (4 dpi) 时这种升高的反应可能反映了肥胖微型猪中病毒清除动力学的改变，表明与瘦型动物相比，呼吸道组织中抗病毒反应的动态差异。这种反应可能代表了肥胖中免疫反应调控的改变，可能有助于病毒清除和组织免疫激活的差异。来自肥胖个体原代人鼻上皮细胞的证据支持这种解释，与瘦型对照组相比，显示 IAV 感染后更明显的炎症和组织损伤，以及 C–C 基序趋化因子配体 20 (CCL20)、纤溶酶原激活物抑制剂 -1 (PAI-1)、白细胞介素 8 (IL-8)、白细胞介素 1 β (IL-1β) 和 IFN-β 等炎症介质水平升高。

气管转录组学观察到的抗病毒免疫反应改变伴随着感染后第 4 天四头肥胖猪中有两头出现免疫细胞浸润，而在感染后 4 天的瘦肉组中未观察到此类浸润。肺部的组织病理学检查显示，瘦肉-IAV 组中的一头猪在感染后 4 天时支气管和细支气管显示轻度中性粒细胞渗出，而肥胖-IAV 组中四头猪中有三头观察到肺泡巨噬细胞。在感染后 4 天，无论是肥胖-IAV 组还是瘦肉-IAV 组的肺部均未发现相应的免疫基因表达差异。这表明观察到的细胞变化可能并不直接反映该时间点的转录水平变化，可能反映了细胞浸润和基因表达在时间动态上的差异。以前一项饮食诱导肥胖小鼠模型的研究报道了 IAV 感染后肺部单核细胞招募的时间发生改变，包括细胞浸润延迟。在小鼠研究中也描述了类似的时间差异，其中肥胖影响免疫细胞浸润的动力学。综合这些研究以及目前的发现，表明肥胖可能与 IAV 感染后肺部免疫反应时间改变有关。重要的是，组织病理学分析是在随机选择的动物子集（每种情况四头猪）上进行的。虽然采用了随机选择，但在解释组织学发现时应考虑这种有限的样本量。与 mock 感染对照组相比，瘦猪和肥胖猪在 IAV 感染后血清 CRP（炎症的关键指标）增加，表明流感感染引发了炎症反应，尽管该反应的程度在不同饮食组之间存在差异。高脂饮食和流感的组合产生了最高的绝对 CRP 浓度，表明整体炎症负荷增强，支持高脂饮食可能放大对病毒感染的炎症反应的观点。这与其他实验模型一致，显示高脂饮食或肥胖会加剧流感诱导的炎症和病理。

总之，这项关于肥胖诱导代谢炎症猪只气道对 IAV 反应的首次研究揭示了肥胖中免疫动态的复杂性，即免疫系统在基线时可能表现正常，但在压力（包括呼吸道感染）下会有不同的反应。使用转化性大型动物模型，研究发现肥胖相关的代谢炎症调节了 IAV 感染期间的抗病毒和炎症反应，差异基因表达模式可能受瘦型与肥胖宿主中病毒载量和反应动力学改变的影响。尽管在感染前肥胖猪中仅观察到抗病毒基因表达、蛋白质丰度和免疫细胞浸润的微小差异，但在肥胖背景下 IAV 攻毒似乎与抗病毒和炎症反应的差异以及病毒清除效率有关。这些结果突显了肥胖伴随代谢炎症时宿主免疫是如何重塑的，并可能有助于解释人类呼吸道感染易感性和严重程度的增加。

研究局限性

必须承认，抗病毒和炎症反应受多种因素影响，包括宿主物种、性别差异、病毒毒株、采样时间和组织采样部位。这些变量可能导致不同研究和模型系统中免疫反应的变异性，强调了病毒感染期间宿主免疫反应的复杂性。为了全面表征代谢炎症背景下感染前后组织驻留和浸润的免疫细胞，单细胞转录组学将是一种有价值的方法，用于更详细地研究局部呼吸细胞动态。本研究的另一个局限性是组织表征仅在感染后单一时间点（4 dpi）进行。因此，无法解决病毒复制、免疫细胞招募和炎症反应的时间动态。未来的肥胖猪研究应包括更早的时间点，以更好地表征固有抗病毒免疫的动力学，并探索病毒复制和进化，正如在小鼠和雪貂研究所展示的那样。尽管感染后 4 天肥胖猪中的病毒 RNA 较高，但这并不一定反映存在感染性病毒，特别是在晚期时间点，缺陷病毒可能积累。因此，测量感染性病毒（如 TCID50 或空斑形成单位）将提供关于病毒复制和感染性的额外见解；然而，由于样本储存条件不理想，这在目前的研究中是不可行的。最后，尽管转录组分析确定了与肥胖中抗病毒和炎症反应改变一致的路径和基因表达模式，但提出的机制解释基于转录组关联，需要进一步的功能验证以确认其生物学相关性。虽然与传统的杂交猪相比，哥廷根小型猪是一个相对遗传均一的猪种，但它们并非完全近交，个体之间的生物学变异性仍然明显。这种差异可能反映所示结果的变异性，并反映了人类群体中看到的异质性。最后，mock 组中动物数量相对较少（每组 n = 4）是一个潜在的局限性，在未来的研究中纳入更多对照有助于进一步增强统计功效和对发现的信心。

资源可用性

主要联系人

有关更多信息和资源的请求应发送给主要联系人 Betina Lyngfeldt Henriksen ([e-mail])，并将由其履行。

材料可用性

本研究未生成新的独特试剂。

数据和代码可用性

•RNA 测序数据已存入基因表达综合数据库 (GEO): GSE319516，自发表日期起公开可用。蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作伙伴仓库存入蛋白质组交换联盟：PXD074506，自发表日期起公开可用。
•本文报告的所有其他数据将由主要联系人根据请求分享。
•本文未报告原始代码。
•重新分析本文报告数据所需的任何额外信息均可根据请求从主要联系人处获得。

致谢

作者感谢技术人员和学生他们在实验室中的技术贡献。作者进一步感谢参与 Lindholm 动物实验的所有工作人员。本文呈现的工作得到了丹麦独立研究基金，技术与生产科学（资助号 3105-00073B）的支持，并由诺和诺德基金会资助的 FluZooMark 项目（资助号 NNF19OC0056326）支持。

作者贡献

概念化，K.S. 和 S.M.R.S.；动物实验，K.S., S.M.R.S., L.L., 和 L.E.L.；方法，B.L.H., S.M.R.S., P.M.H.H., 和 K.S.；分析，B.L.H., S.M.R.S., L.B., C.K., S.W., 和 A.S.；可视化，B.L.H., L.B., 和 K.S.；写作 - 原稿，B.L.H. 和 S.M.R.S.；写作 - 审查和编辑，B.L.H., S.M.R.S., L.B., C.K., S.W., L.L., A.S., H.E.J., L.E.L., P.M.H.H., 和 K.S.；资金获取，K.S.；监督，K.S. 和 P.M.H.H.；项目行政，K.S.

利益声明

作者声明没有竞争利益。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 来源 标识符
抗体 兔抗人 CRP 抗体 DAKO A073
HRP 标记山羊抗兔 IgG DAKO P217
细菌和病毒株 甲型流感病毒，A/swine/Denmark/12687/2003 (H1N2) 丹麦国家血清研究所 (SSI) N/A
化学品、肽和重组蛋白 cOmplete? Mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂 cocktail 片剂 Roche 目录号：04693159001
BCA 快速金测定法 Thermo Fischer Scientific 目录号：A55860
LysC Wako 目录号：125-05061
胰蛋白酶 Promega 目录号：V5280
关键商业检测试剂盒 miRNeasy Mini 试剂盒 Qiagen 目录号：217604
SensiFast Probe No-ROX One-Step Mix 试剂盒 Meridian Bioscience 目录号：BIO-76005
QuantiTect 逆转录试剂盒 Qiagen 目录号：205314
TagMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems 目录号：4384267
沉积数据 RNA-seq 数据 本文 GEO: GSE319516
蛋白质组学数据 本文 PRIDE: PXD074506
实验模型：生物体/株系 哥廷根小型猪 Ellegaard G?ttingen minipigs A/S N/A
寡核苷酸 IAV 的引物和探针：RimF (5′-CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG-3′), RimR (5′-AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA-3′) 和 MAprobeDL (5′-FAM CCC AGT GAG CGA GGA CTG CAG CGT BHQ-1-3′) 本文 N/A
宿主基因表达的引物见表 S2、S9 和 S10 本文 N/A
软件和算法 Dr. Tom 可视化解决方案 BGI Genomics https://www.bgi.com/global/service/dr-tom
SpectronautTM (版本 18.6) BOPGNOSYS https://biognosys.com/software/spectronaut/
Fluidigm 实时 PCR 分析软件 4.7.1 Standard Biotools https://standardbio.com/products-services/software/
GenEx7 Pro 软件 MultiD Analysis AB https://multid.se/product/genex/
在新标签页中打开表格

实验模型和研究参与者详情

动物

本研究经丹麦食品、农业和渔业部动物实验监察局批准（许可证号 2016-15-0201-01022）。

去势的九周大哥廷根小型猪 (n = 26) 被随机分为两个饮食组，饲喂高脂肪、果糖和胆固醇的饮食 (n = 13) (Ossabaw 猪饮食 – 5B4L, TestDiet, 表 S6) 或标准小型猪饲料 (SD, n = 13) (Mini-pig, Special Diets Services, 表 S6) (图 1)，自由饮水，并在 12 小时光/12 小时暗循环中饲养。肥胖猪饲喂量为该组平均体重的 2.5–3.0%，并根据体重测量每周调整配给。开始饲喂 99 天后（此后称为 0 dpi），肥胖 (n = 9) 和瘦肉 (n = 9) 组（分别指定为肥胖 -IAV 和瘦肉 -IAV）的猪通过黏膜雾化设备 (Mad Nasal 鼻内黏膜雾化设备 (Teleflex) 接种每鼻孔 2 毫升 1.6×10^8 TCID50/ml A/swine/Denmark/12687/2003 (H1N2) IAV。接种前，所有猪均通过肌肉注射进行镇静。肥胖 (n = 4) 和瘦肉 (n = 4) 猪组（分别指定为肥胖 -mock 和瘦肉 -mock）接种每鼻孔 2 毫升无病毒生长培养基。从 0 到 4 dpi 每天采集血液和鼻咽拭子样本 (图 1A)。在 4 dpi，所有 26 头猪被安乐死，并采集呼吸道组织样本（鼻黏膜、上气管、下气管和肺）(图 1B)。

方法详情

RNA 提取

使用 gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec) 进行匀浆并根据制造商方案使用 miRNeasy mini 试剂盒 (Qiagen) 提取鼻黏膜、气管和肺组织的总 RNA。使用 Oragene RNA RE-100 纯化方案 (DNA Genotek) 和 RNeasy Micro 试剂盒 (Qiagen) 从鼻咽 FLOQswab 样本 (COPAN) 中提取总 RNA。鼻咽样本在 50°C 水浴中孵育一小时，并将 550 μL 样本分装到微量离心管中。洗脱过程中，洗脱液通过膜两次以提高 RNA 产量。

IAV 定量

使用一种改进版本的 RT-qPCR 检测方法通过靶向基质 (M) 基因来检测 IAV，采用 SensiFast Probe No-ROX One-Step Mix 试剂盒 (Meridian Bioscience)。使用的引物为 RimF (5′-CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG-3′) 和 RimR (5′-AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA-3′) 以及探针 MAprobeDL (5′-FAM CCC AGT GAG CGA GGA CTG CAG CGT BHQ-1-3′)。每个反应最终体积为 25 μL，包含 3 μL RNA 模板，13 μL SensiFAST Probe No-ROX One-Step Mix (Meridian Bioscience)，0.55 μL RiboSafe RNase 抑制剂 (Meridian Bioscience)，0.28 μL 逆转录酶 (Meridian Bioscience)，7 μL 无 RNase 水，以及 2 μL 引物 - 探针混合物，由 0.08 μL 每种引物（最终浓度 0.4 μM），0.06 μL 探针（最终浓度 0.3 μM）和 1.78 μL 无 RNase 水组成。扩增在 Rotor-Gene Q 平台 (QIAGEN) 上进行，条件如下：50°C 逆转录 30 分钟，95°C 初始变性 2 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环 95°C 15 秒，55°C 15 秒，72°C 20 秒。

RNA-seq 数据分析

RNA-seq 文库根据制造商规格 (BGI Genomics) 使用非链特异性 PolyA 选择方法构建。清洁读段比对到猪基因组（参考基因组版本 GCF_000003025.6_Sscrofa11.1）。使用 BGI Genomics 可视化工具 Dr. Tom 进行数据分析和可视化。在气管的 RNA-seq 分析中产生了约 22 亿个清洁读段，每个样本平均获取 8920 万个 (8880 万 -9280 万)。在所有样本中，98-98.87% 的清洁读段比对到猪基因组，92.3-95.72% 的清洁读段被唯一比对（比对到参考基因组上的唯一位置）(表 S7)。所有鉴定出的差异表达基因及其表达水平可在表 S1 中找到。瘦肉 -IAV 组的一个样本已降解（RNA 完整性为 2.4），未包含在 RNA-seq 数据分析中。RNA 测序数据已存入基因表达综合数据库 (GEO)，登录号为 GSE319516。

cDNA 合成、预扩增和外切酶处理

使用 QuantiTect 逆转录试剂盒 (Qiagen) 根据制造商方案，从 300 ng 鼻咽拭子样本总 RNA 和 500 ng 呼吸道组织总 RNA 中合成互补 DNA (cDNA) 重复份。样本和–RT 对照（无逆转录酶的 cDNA 合成）使用 TagMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) 根据制造商方案进行预扩增，呼吸道组织应用 19 个循环扩增，鼻咽拭子应用 22 个循环。

高通量 qPCR

使用分别靶向 96 和 24 个基因的两个面板进行 qPCR 分析，每个面板包括 3-5 个候选参考基因 (表 S8、S9 和 S10)。

96 引物面板用于验证下气管和 0-4 接种后天数 (dpi) 鼻咽拭子样本的 RNA-seq 结果，而 24 引物面板基于 RNA-seq 数据，应用于 4 dpi 的鼻黏膜、上气管和肺组织。测定在 BioMark 实时 PCR 平台 (Standard Biotools) 上进行，使用 96.96 和 192.24 动态阵列集成流体电路芯片，遵循制造商规范。每对引物的 qPCR 效率及动态范围通过使用从鼻黏膜、上和下气管及肺组织的独立混合池制备的系列稀释液确定。qPCR 数据使用 Fluidigm 实时 PCR 分析软件 4.7.1 (Standard Biotools) 和 GenEx7 Pro 软件 (MultiD Analysis AB) 进行检查和处理。定量循环数 (Cq) 通过 PCR 效率 (80-120%) 校正。对于每种组织，使用 geNorm 和 NormFinder 评估候选参考基因在所有实验组中的稳定性，并使用最稳定的基因进行标准化。鼻黏膜：核糖体蛋白 L13a (RPL13A)、肽酰脯氨酰异构酶 A (PPIA)；上气管：RPL13A、酪氨酸 3-单加氧酶 (YWHAZ)；下气管：β-2-微球蛋白 (B2M)、PPIA、YWHAZ；肺组织：RPL13A、YWHAZ；鼻咽拭子样本：β-肌动蛋白 (ACTB) 和甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)。瘦型假感染组和肥胖型假感染组均缩放至 1，相应的感染组相对于各自的假感染对照进行标准化。

组织病理学染色。对所有 8 头假感染猪以及每个 IAV 接种组中随机选择的 4 头猪进行组织学检查。每个组中 4 头猪的组织标本固定于 10% 中性缓冲福尔马林，石蜡包埋，切片 3-4 μm，并用苏木精 - 伊红 (H&E) 染色。

C 反应蛋白 (CRP) 的 ELISA 定量。CRP 血清浓度通过间接 ELISA 测定，使用 Nunc Maxisorp 板，在 4°C 下用 CDP 偶联树状大分子 (150–200 ng/mL) 包被过夜。洗涤并用 5% 脱脂牛奶封闭后，将样本和标准品重复加入并孵育 1 小时，37°C。随后将板与兔抗人 CRP 抗体 (DAKO A073) 孵育，接着与 HRP 标记羊抗兔 IgG (DAKO P217) 孵育。信号显色使用 TMB 底物，用 0.5 M 硫酸终止，在 490 nm 处测量吸光度，并以 650 nm 进行背景校正。定量下限为 1.42 mg/L。

蛋白质组学 - 样本制备。样本在裂解缓冲液 (6 M 盐酸胍 (GuHCl), 10 mM 三 (2-羧乙基) 膦 (TCEP), 40 mM 氯乙酰胺 (CAA), 50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES), pH 8.5，含 cOmplete? Mini EDTA 游离蛋白酶抑制剂混合物) 中均质化，使用 TissueLyser II (Agilent) 和一颗钢珠，在 1–30 Hz 下研磨两次，每次一分钟。样本在 95°C 孵育 5 分钟，裂解物在 -20°C 下在丙酮中沉淀过夜，4°C 下 4000x g 离心 20 分钟，并重悬于裂解缓冲液中。蛋白浓度使用 BCA 快速金检测 (Thermo Fischer Scientific) 测定，取 20 ug 进行消化。样本用 10% 乙腈，50 mM HEPES pH 8.5 稀释 1:3，加入 LysC (质谱级，Wako)，比例为 1:50 (酶与蛋白)，样本在 37°C 孵育 4 小时。样本进一步用 10% 乙腈，50 mM HEPES pH 8.5 稀释至 1:10。加入胰蛋白酶 (质谱级，Promega)，比例为 1:100 (酶与蛋白)，样本在 37°C 孵育过夜。样本用 2% 三氟乙酸 (TFA) 酸化至 pH < 2，并按照制造商方案加载到 EvoSep 层析吸头上。

蛋白质组学 - 分析。使用 EvoSep One 仪器预设的“每天 20 个样本”方法分析肽段。肽段在 58 分钟梯度中洗脱，并使用 Orbitrap Exploris 仪器 (Thermo Fisher Scientific) 进行分析，该仪器以 DIA 模式运行，配备 FAIMS ProTM 接口 (ThermoFisher Scientific)，补偿电压 (CV) 为 -45 V。全扫描 MS 谱图收集分辨率为 120,000，AGC 目标为 300% 或最大注射时间设定为 50 ms，扫描范围为 400–1350 m/z。MS2 谱图在 DIA 模式下于轨道阱中获得，分辨率为 15,000，AGC 目标为 1000% 或最大注射时间设定为“自动”，归一化 HCD 碰撞能量为 33。隔离窗口设定为 20 m/z，重叠 1 m/z，并开启窗口位置优化。DIA 扫描的循环时间设定为 3 秒。通过运行复杂细胞裂解物质控标准品验证 MS 性能的一致性，并监测色谱以检查重现性。

蛋白质组学 - 数据分析。原始文件使用 SpectronautTM (版本 18.6) 分析，谱图与猪 (Sus scrofa) 数据库 (UP000008227) 匹配。动态修饰设定为氧化 (M) 和蛋白 N 端乙酰化。半胱氨酸氨基甲酰化设定为静态修饰。所有结果过滤至 1% 错误发现率 (FDR)，并在 M21 水平进行蛋白定量。仅包括蛋白质型肽进行定量，蛋白组由 IDPicker 推断。质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作伙伴仓库存入 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD074506。

定量与统计分析。首先使用 Shapiro–Wilk 检验测试病毒 RNA 丰度差异的正态性，并使用 Levene's 检验评估方差齐性，随后进行独立双样本 t 检验。对血清 CRP 浓度应用混合方差分析 (Mixed ANOVA)，以评估五天采样期间时间的影响。使用双侧 Welch's t 检验进行事后分析，并使用 Benjamini-Hochberg 程序 (α=0.05) 调整 p 值以进行多重比较。蛋白质组学数据经过 log2 转换并检查正态性。进行 t 检验并使用 Benjamini-Hochberg 错误发现率校正多重测试。RNA-seq 数据经过标准化，并使用 DESeq2 识别组间差异表达基因 (DEGs)，使用 Benjamini-Hochberg 程序调整 p 值以进行多重比较。DEGs 定义为 q 值低于 0.05 且倍数变化为±1.5。qPCR 数据在统计分析前经过 log2 转换以满足正态性假设。对 qPCR 结果进行 Welch's t 检验。鼻咽拭子样本通过曲线下面积 (AUC) 和图基诚实显著差异 (Tukey HSD) 分析，并使用 Benjamini-Hochberg 程序调整 p 值以进行多重比较。数据表示为均值±标准误 (SEM)，除非相应图注中另有说明。每个实验的精确样本量 (n) 和使用的统计检验提供在相关图注中，其中 n 代表每个分析中包含的个体动物数量，除非另有说明。

补充信息 (1) PDF (1003.34 KB) 文档 S1。图 S1 和 S2，以及表 S1–S10。