海鞘成体脑的空间转录组学揭示功能分区和神经腺功能见解

《iScience》：Spatial transcriptomics of Ciona adult brains reveals functional zonalization and insights into neural gland function

　　

海鞘（Ciona）是一种关键的脊索动物模型，用于阐明脊椎动物脑的进化起源。在本研究中，研究人员对成体海鞘神经复合体进行了空间转录组学分析，并结合基于图像的计算超分辨率作图，解析了不同的组织区域，包括脑神经节（cerebral ganglion）、神经腺（neural gland）、纤毛漏斗（ciliated funnel）、神经腺管/背索（neural gland duct/dorsal strand）和体壁肌肉（body wall muscle）。在脑神经节内，高分辨率作图揭示了清晰的分子分区，将皮质（cortex）和髓质（medulla）分开，同时皮质内部也存在区域特化。神经腺表现出与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和细胞-细胞相互作用相关的基因的局部富集。这些空间特征表明，神经腺起到稳态和信号接口的作用，类似于原始脊椎动物的脑膜（meninges）或脉络丛（choroid plexus）。总体而言，这一空间定义的基因表达图谱为理解尾索动物脑的功能区域化及其与脊椎动物神经系统的进化关系提供了基础框架。

**论文解读：海鞘成体神经复合体的空间转录组图谱揭示功能分区与神经腺潜在功能**

**研究背景与意义**
海鞘（*Ciona*）作为脊椎动物最近的近亲（尾索动物），是研究脊椎动物脑进化起源的关键模型。迄今，海鞘幼虫脑在转录组和细胞层面已有广泛表征，但其成体脑——即神经复合体（neural complex），主要由脑神经节（cerebral ganglion）和神经腺（neural gland）构成——却研究较少，原因在于转基因技术应用于成体困难，且细胞类型及其分布信息匮乏。已有解剖学图谱描述了周围神经支配，神经肽成像揭示了脑神经节内的区域神经化学组织，但缺乏将细胞身份、分子程序与解剖结构联系起来的高分辨率空间转录组图谱。因此，研究人员利用空间转录组学（spatial transcriptomics）结合计算超分辨率作图，系统解析了成体海鞘神经复合体的分子空间架构，以期揭示其功能区域化，并探讨神经腺与脊椎动物脑膜/脉络丛的潜在进化同源性。该研究发表于《iScience》。

**主要技术方法**
研究人员从3个成年海鞘（*Ciona robusta*，也称*Ciona intestinalis* type A，来源：京都大学舞鹤水产研究站，国家生物资源项目提供）的脑部连续获取4个10 μm矢状切片，共12个切片，分布于10× Genomics Visium平台的捕获区域。通过Visium空间基因表达试剂盒进行转录组测序，平均每个样本获得约4亿条读段。使用Space Ranger v1.3.1比对到KH2013参考基因组，Seurat v4进行聚类分析，并采用典型相关分析（CCA）矫正批次效应。为提升空间分辨率，研究人员应用Xfuse软件整合组织学图像特征与转录组数据，生成超分辨率基因表达图谱，最终获得约980个基因的高分辨率表达图。

**研究结果**
**海鞘成体脑的空间转录组景观**
通过聚类分析，在整合后的数据中识别出5个主要簇（图1E）。这些簇在个体间和Visium载玻片间重复出现，表明聚类结果具有稳健性。经过组织学结合差异表达基因注释，5个簇分别对应：脑神经节、神经腺、纤毛漏斗、神经腺管/背索以及体壁肌肉。其中，体壁肌肉基于基因本体（GO）富集到肌肉结构与收缩相关术语；纤毛漏斗通过其最前部位置和纤毛组织相关GO术语注释；神经腺管/背索则依据其与脑神经节和神经腺的相对空间位置确定。

**海鞘成体脑的组织注释**
通过差异表达分析，研究人员为每个簇鉴定了特异性标记基因（图2A）。例如，脑神经节标记基因富集于神经递质代谢和突触功能，神经腺标记基因富集于细胞外基质（ECM）和细胞黏附，体壁肌肉标记基因富集于肌肉收缩，纤毛漏斗标记基因富集于纤毛运动。

**海鞘脑超分辨率基因图谱构建**
利用Xfuse整合转录组与图像特征，生成超分辨率基因表达图。与原始Visium点级表达相比，Xfuse推断的图谱显示出更锐利的空间边界和更精细的内部组织，例如*ci-galp*、*ci-ntlp-A*、*ci-vfyl/l*、*ci-lf*和*vasopressin receptor*在脑神经节皮质区域富集，*somatostatin receptor*局限于神经腺，与已有原位杂交数据一致。

**神经腺新标记基因的鉴定**
通过超分辨率图谱，研究人员在神经腺中鉴定出85个高度一致的标记基因（表S1）。这些基因包括ECM相关基因（如*KH.C1.1211* laminin、*KH.C5.562* dystroglycan、*KH.C8.476* lysyl oxidase like 3）、神经支持与轴突导向分子（如*KH.C12.72* netrin 1、*KH.C5.524* netrin 4、*KH.S749.1* glial fibrillary acidic protein, GFAP）、跨膜受体与黏附分子（如*KH.C11.90/KH.C8.337* somatostatin receptors、*KH.C2.341* G-protein-coupled receptor 107）、溶质载体家族（SLC）转运体（如*KH.C7.199*、*KH.L4.19*）以及细胞生长分化相关蛋白（如*KH.C2.605* hedgehog interacting protein）。这些分子特征提示神经腺具有独特的细胞间相互作用和细胞外环境，支持其分泌和界面功能。

**脑神经节新标记基因的鉴定**
在脑神经节中，超分辨率基因表达图谱将基因表达模式分为四类：①皮质均匀表达（如*KH.C7.92* NMDA receptor、*KH.S618.6* galanin-like neuropeptide precursor），与神经递质（GABA）和神经肽生物合成、突触功能相关；②中央皮质（面向神经腺的腹侧区域）表达（如*KH.C1.421* 4-aminobutyrate aminotransferase, ABAT、*KH.C1.498* choline O-acetyltransferase、*KH.C9.885* vasopressin receptor），提示特化的神经递质反应和突触囊泡释放；③前后皮质（远端区域）表达（如*KH.C2.491* golgin A4、*KH.C4.437* Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase IV），分子功能与神经元和突触功能关联较弱；④髓质表达（如*KH.L55.2* calmodulin、*KH.C9.150* doublecortin-like and CAM kinase-like 2、*KH.C8.892* α-tubulin），与钙信号和细胞骨架结构相关，提示髓质作为结构核心和调控中心。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次构建了海鞘成体神经复合体的空间转录组图谱，不仅定义了主要组织区域，还通过超分辨率作图揭示了脑神经节内部的分子异质性（皮质、中央皮质、前后皮质、髓质）和神经腺的独特分子特征。神经腺标记基因中ECM、SLC转运体、GPCR、GFAP等富集，支持其可能作为稳态和信号接口，与脊椎动物脑膜（尤其是软脑膜）和脉络丛具有功能相似性。脑神经节皮质区域富集神经递质合成与突触相关基因，而髓质富集钙信号和微管组分，提示功能分区。研究还指出当前局限性：基于点水平的测量需整合单细胞RNA测序以进一步解析细胞异质性；Xfuse超分辨率图谱可能遗漏低表达区域；未进行调控网络分析；神经腺与脊椎动物脑膜/脉络丛的同源性假说尚需功能实验验证。
**研究结论**：总之，本分析揭示了脑神经节中先前未被认识的分子异质性，特别是皮质内部。这一空间定义的基因表达图谱为理解尾索动物脑的功能区域化及其与脊椎动物神经系统的进化关系提供了基础框架。