《Archives of Toxicology》：A human PBMC-based new approach method reveals PFAS-driven T-cell proliferation and immune dysregulation
编辑推荐：
免疫毒性已成为全氟和多氟烷基物质（PFAS）的关键健康问题，动物研究显示T依赖性抗体反应（TDAR）降低，流行病学研究报告疫苗抗体滴度下降。值得注意的是，免疫毒性被认为是PFAS暴露最敏感的终点之一，并被用于指导监管指南和健康基准值。鉴于超过14,000种PF
免疫毒性已成为全氟和多氟烷基物质（PFAS）的关键健康问题，动物研究显示T依赖性抗体反应（TDAR）降低，流行病学研究报告疫苗抗体滴度下降。值得注意的是，免疫毒性被认为是PFAS暴露最敏感的终点之一，并被用于指导监管指南和健康基准值。鉴于超过14,000种PFAS存在且高度环境持久，评估单个化合物的免疫毒性至关重要但不切实际，凸显了对高效、人源相关测试系统的需求，这些系统应提供具有机制信息且免疫相关的终点。在此，研究人员使用体外人外周血单个核细胞（PBMC）模型评估了六种PFAS类似物的免疫调节效应。应用了两种免疫刺激物，包括脂多糖（LPS）以触发先天反应，以及植物血凝素（PHA）以模拟T细胞介导的适应性免疫激活。关键的是，几种PFAS类似物在PHA激活后增强了T细胞增殖，而一个非包含性但重叠的类似物子集抑制了响应PHA和LPS的细胞因子分泌。转录组学分析表明B细胞特征和免疫球蛋白基因表达降低，同时与T细胞活化和增殖相关的基因表达增加。这些发现表明T细胞和B细胞反应之间的失调协调是PFAS相关免疫毒性的潜在机制。总体而言，人PBMC模型证明是一种成本效益高且符合伦理的方法，用于识别和表征PFAS诱导免疫毒性的不良结局通路（AOP）中的关键事件（KEs），并具有被优化并整合到稳健的新方法（NAM）中以评估下一代商业PFAS的潜力。
**论文解读：基于人PBMC模型揭示PFAS驱动的T细胞增殖与免疫失调机制**
**研究背景与问题**
全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类人工合成化学品，因其极端的化学和热稳定性在环境中广泛存在，并通过食物、水、室内灰尘及消费品等途径持续暴露于人类。流行病学和动物研究一致表明，PFAS暴露与免疫毒性密切相关，尤其是T依赖性抗体反应（TDAR）的抑制和疫苗抗体滴度的下降，这使得免疫毒性成为PFAS风险评价中最敏感的终点之一，并已被欧洲食品安全局（EFSA）等机构用于制定每周耐受摄入量（TWI）。然而，全球已识别出超过14,000种PFAS化合物，传统体内啮齿动物实验（如TDAR检测）耗时、资源密集且存在种属差异（如PPARα信号通路），难以满足高通量筛选需求。此外，现有体外研究多聚焦于PFAS对B细胞或细胞因子分泌的影响，对T细胞活化及增殖的机制研究尚不充分，且缺乏整合人源模型以阐明关键事件（KEs）的框架。因此，亟需开发一种具有机制信息、人源相关且高效的新方法（NAM），用于评估PFAS及相关替代化合物的免疫毒性。
**研究内容与结论**
本研究采用体外人外周血单个核细胞（PBMC）模型，系统评估了六种PFAS类似物（包括长链与短链、羧酸与磺酸类，以及替代化合物GenX）的免疫调节效应。研究人员从8名健康成人（4男4女）获取PBMC，预处理24小时后分别用脂多糖（LPS）和植物血凝素（PHA）刺激，模拟先天免疫和T细胞介导的适应性免疫激活，随后检测细胞因子分泌、T细胞增殖及转录组变化。结果显示，多种PFAS类似物（尤其是PFOA和PFNA）在PHA激活后显著增强了CD3+、CD4+和CD8+ T细胞增殖，而另一重叠子集（如PFOS、PFOA、PFNA、PFHxS、PFDA）则抑制了IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。转录组分析进一步揭示，PFOS、PFOA和PFNA处理上调了与T细胞激活、趋化及NF-κB通路相关的基因（如Ccr4、Csf2、Mmp9、Tnfsf15），同时下调了B细胞特异性基因（如Pou2af1）及免疫球蛋白轻链基因（如Igkc、Iglv2-14、Iglc1、Iglc2、Iglc3），提示T-B细胞间协调功能失调。该模型在成本、伦理及人源相关性方面具有优势，可作为识别PFAS诱导免疫毒性不良结局通路（AOP）中关键事件（KEs）的NAM，并支持未来商业PFAS的免疫毒性优先排序。
**关键技术与方法**
主要技术方法包括：①从商业供应商（Miltenyi Biotec）获取经伦理批准的8名健康成人PBMC，并测定其血浆中21种PFAS基线水平（LC-MS/MS）；②采用CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）荧光染料标记细胞以追踪增殖，通过流式细胞术（Sony ID7000光谱细胞分析仪）分析CD3+、CD4+、CD8+ T细胞及非T细胞（CD3?）的分裂比例；③使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液中IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度；④对PFOS、PFOA和PFNA处理的PBMC进行RNA测序（Illumina NextSeq? 2000），经R-ODAF_Health_Canada流程进行差异表达分析和KEGG/GO BP通路富集分析；⑤应用tcplfit2包进行基准剂量（BMD）建模，比较体外与体内（C57BL/6小鼠）数据中TNF-α的起始点（POD）。
**研究结果**
**PFAS诱导的T细胞增殖**：流式细胞术显示，PFOA+PFNA显著增加CD3+ T细胞分裂比例（最低有效浓度0.5 μM）；PFOS、PFOA、PFNA均增加CD4+ T细胞增殖；PFOA和PFNA增加CD8+ T细胞增殖。MFI?1分析进一步揭示所有六种PFAS均诱导一定程度增殖，且磺酸类（如PFOS）主要促进CD4+ T细胞增殖，而羧酸类（如PFOA、PFNA）引起广泛CD3+ T细胞增殖，短链GenX仅对CD8+ T细胞有微弱效应。LPS刺激下未观察到非T细胞增殖变化，且各浓度下细胞活力未见显著下降。
**PFAS诱导的细胞因子分泌减少**：PHA共处理组中，PFOS（50 μM）降低TNF-α，PFOA（100 μM）降低IFN-γ，PFNA和PFHxS（100 μM）降低IL-2，PFDA（100 μM）降低所有三种细胞因子。LPS共处理组中，PFOA和PFDA（50 μM）降低TNF-α。XTT试验排除细胞毒性影响。与先前体内小鼠研究比较，PFOS暴露的TNF-α基准剂量（BMD）在体外（39.87 μM）低于体内（206.67 μM），提示体外模型敏感性更高。
**转录组分析**：PFOS、PFOA和PFNA处理（100 μM + PHA）后，差异表达基因（DEGs）在性别间存在差异。共有上调基因包括Ccr4、Csf2、Mmp9、Tnfsf15等与T细胞激活相关基因；下调基因包括免疫球蛋白轻链基因（Igkc、Iglv2-14、Iglc1、Iglc2、Iglc3）及B细胞关键转录因子Pou2af1。KEGG富集分析显示上调通路包括NF-κB、TNF、IL-17、NOD样受体、细胞因子-细胞因子受体相互作用等；GO BP富集分析显示下调通路涉及B细胞受体信号、B细胞增殖、分化与活化。此外，AhR靶基因（Ahrr、Cyp1b1）也上调，提示NF-κB与AhR通路交叉对话可能参与T细胞分化偏向。
**讨论与结论**
本研究讨论部分指出，PFAS增强T细胞增殖与抑制细胞因子分泌看似矛盾，但可能归因于时间动态差异：早期细胞因子限制可能减弱后期激活诱导的细胞死亡（AICD），从而表现为增殖增加；或通过代谢重编程（如促进糖酵解）改变T细胞耗竭状态。不同PFAS的功能基团（磺酸 vs 羧酸）和碳链长度影响增殖模式，而GenX效应较弱可能与其短链结构及细胞内存留减少有关。转录组证据支持T细胞过度激活伴随B细胞功能抑制，可能通过NF-κB和AhR通路驱动Th1/Th17偏移，减少Tfh细胞分化，最终削弱B细胞存活和抗体产生。该模型在识别PFAS免疫毒性AOP中的KEs（如T细胞增殖改变、细胞因子信号失调）方面具有潜力，并可作为传统动物TDAR检测的替代方案。研究结论翻译如下：总体而言，人PBMC模型证明是一种成本效益高且符合伦理的方法，用于识别和表征PFAS诱导免疫毒性的不良结局通路（AOP）中的关键事件（KEs），并具有被优化并整合到稳健的新方法（NAM）中以评估下一代商业PFAS的潜力。
