《Advanced Science》：Heat-Suppressing Projection Two-Photon Lithography Enables High-Throughput Sub-Micrometer Manufacturing of Biopolymer Hydrogels for Tissue Engineering
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天然组织具有复杂的多尺度层级结构，从厘米级组织排列到亚微米级细胞外基质（ECM）形貌。虽然双光子聚合（TPP）光刻提供了模拟ECM所必需的亚微米精度，但传统的点扫描TPP受限于极低的制造效率。尽管投影双光子光刻（P-TPP）能显著提高通量，但其在生物聚合物水凝
天然组织具有复杂的多尺度层级结构，从厘米级组织排列到亚微米级细胞外基质（ECM）形貌。虽然双光子聚合（TPP）光刻提供了模拟ECM所必需的亚微米精度，但传统的点扫描TPP受限于极低的制造效率。尽管投影双光子光刻（P-TPP）能显著提高通量，但其在生物聚合物水凝胶中的应用受到强烈局部热积累的严重阻碍，常导致材料碳化和生物活性受损。在本研究中，研究人员开发了一种热抑制P-TPP平台，克服了这些热学限制。通过采用低放热的II型光引发体系，研究人员在高功率聚合过程中有效减轻了热损伤，实现了具有亚微米分辨率的水凝胶微单元的高保真制造。这一技术进步使生产效率较传统点扫描TPP提高了3–4个数量级。为弥合微观精度与宏观组织工程之间的鸿沟，研究人员进一步将该平台与挤出式打印相集成，形成一种称为集成光刻与挤出增材制造（iLEAP）的工艺。这种多尺度制造方法可将工程化微单元组装成复杂的宏观水凝胶结构，为细胞排列和功能性组织成熟提供关键的结构线索。该平台为面向先进生物医学应用的多尺度水凝胶制造提供了一种可扩展的范式。
论文解读：热抑制投影双光子光刻实现生物聚合物水凝胶的高通量亚微米制造用于组织工程
该研究发表于《Advanced Science》。天然组织呈现从厘米级宏观排列到亚微米级细胞外基质（ECM）形貌的多尺度层级结构。水凝胶虽具有仿ECM的生物相容性和营养扩散优势，但如何在宏观尺度上兼顾制造通量与亚微米结构精度，一直是组织工程领域的长期挑战。传统数字光处理（DLP）分辨率受衍射极限限制，而双光子聚合（TPP）虽能突破衍射极限，但串行点扫描模式导致效率极低。投影双光子光刻（P-TPP）通过并行曝光大幅提升通量，却因高能量密度引发局部热积累，导致生物聚合物水凝胶碳化及生物活性丧失。为此，研究人员开发了热抑制P-TPP平台，并进一步与挤出打印集成，提出iLEAP（集成光刻与挤出增材制造）策略，旨在桥接微观精度与宏观组织构建。
研究人员采用低放热的II型光引发体系，以曙红Y（EY）/三乙醇胺（TEOA）作为引发剂，通过双淬灭机制减少非辐射跃迁产热，避免了传统裂解型光引发剂（如LAP、Irgacure 2959）在打印中因过热导致的碳化。基于该体系，P-TPP平台实现了亚微米分辨率的复杂水凝胶微单元（HMPs）高通量制造，制造速度较传统点扫描TPP提升3–4个数量级，每小时可生产815个颗粒。随后，研究人员将这些HMPs作为生物墨水进行挤出打印，通过调控颗粒长径比、浓度和挤出/写入速度比实现定向排列，进而组装成宏观多尺度结构。研究还通过EDEM模拟和细胞实验验证了多孔HMPs对细胞浸润和血管形成的促进作用，并利用微沟槽HMPs实现各向异性组织构建，最后通过粗粒化模拟揭示了形貌引导细胞排列的力学机制。
关键技术方法包括：基于数字微镜器件（DMD）的投影双光子光刻系统；低放热II型光引发体系的光物理表征与自由基验证；集成挤出打印的iLEAP工艺流程；EDEM离散元模拟颗粒取向与细胞渗透；粗粒化计算模型模拟细胞-ECM相互作用。样本来源包括从新生Sprague-Dawley大鼠脑内提取的原代皮层神经元，以及NIH 3T3成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）等细胞系。
2.1 P-TPP of Hydrogels With Type II Photoinitiating System
通过紫外-可见光谱、荧光寿命和纳秒闪光光解等表征，研究人员证实了EY/TEOA体系采用双淬灭机制，可显著抑制非辐射跃迁产热，从而拓宽打印窗口，实现高保真的水凝胶图案化聚合。
2.2 HMP Fabrication by P-TPP Technique
通过压缩测试和打印参数优化，确定最佳EY浓度为0.4 mM、GelMA浓度为20% w/v。该体系兼容蛋白基（GelMA、SilMA）和多糖基（HAA、Dex-GMA）水凝胶，并保持亚微米特征尺寸。该系统可实现大规模阵列化制造，并可通过挤出打印实现HMPs的定向组装，其排列质量由长径比、颗粒浓度及挤出/写入速度比共同决定。
2.3 Customized Porous HMPs Promoting Cell Infiltration and Microtubular Tissue Formation
EDEM模拟与共培养实验表明，孔径大于细胞核（约15 μm）的贯通孔道允许细胞浸润，而小孔则阻碍渗透。管状HMPs因具有连续纵向通道和更高孔隙率（56% vs 实心35%），显著促进了F-肌动蛋白网络形成（覆盖率达57% vs 25%），并可在管腔内形成连续的内皮细胞层，用于构建血管网络。
2.4 Microgrooved HMPs as Topographical Cues for Aligned Tissue Engineering
通过制备具有2–30 μm宽纵向微沟槽的棒状HMPs，并与原代皮层神经元及NIH 3T3成纤维细胞共培养，发现2–4 μm的窄沟槽能强烈诱导细胞骨架和细胞核沿沟槽方向排列。在21天培养中，微沟槽HMP支架较各向同性微球（HMSs）表现出更优的细胞定向、胶原沉积（Col1a1）以及更高的弹性模量和断裂强度。
2.5 Mechanistic Insights Into Topography-Induced Cell Alignment via Simulations
粗粒化模拟揭示，沟槽宽度通过影响细胞凹凸区域接触和黏着斑分布产生尺寸依赖的接触引导：2–4 μm沟槽与细胞感知元件尺度匹配时诱导强定向，而1 μm及20–30 μm则导致随机取向。此外，高表面曲率通过膜弯曲能各向异性驱动细胞沿轴向排列，而低曲率表面则缺乏明确导向。
结论：iLEAP技术通过集成高通量热抑制投影双光子光刻与可扩展挤出打印，实现了亚微米精度与宏观组织构建的层级化桥接。利用低放热II型光引发体系避免热损伤，平台可精确编程微沟槽宽度和表面曲率等拓扑线索，引导细胞排列和功能性组织成熟。该多尺度制造策略为构建复杂血管网络和具有增强结构成熟度的各向异性结缔组织提供了通用方案，并有望推动先进细胞制造及再生医学的临床转化。
