《Marine Environmental Research》：Near-infrared hyperspectral imaging as a rapid tool for detection of toxin-producing microalgae in seawater
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近红外高光谱成像（NIR-HSI）作为一种快速、非破坏性的筛查工具，被评估用于直接检测天然海水样品中的有害产毒微藻。研究人员对2020年5月至2021年6月期间在葡萄牙Ria de Aveiro潟湖两个站点每周至每两周采集的为期一年的样品进行了分析，涵盖了浮游
近红外高光谱成像（NIR-HSI）作为一种快速、非破坏性的筛查工具，被评估用于直接检测天然海水样品中的有害产毒微藻。研究人员对2020年5月至2021年6月期间在葡萄牙Ria de Aveiro潟湖两个站点每周至每两周采集的为期一年的样品进行了分析，涵盖了浮游植物群落的强烈季节性和年际变化。在900–1700 nm范围内记录了过滤海水样品的高光谱图像，并通过多元图像分析进行处理。细胞计数和分类学鉴定采用参考方法Uterm?hl倒置显微镜法，针对产生AST、PST、DST、YTX和AZT毒素的物种。基于平均图像光谱构建的PLS-DA模型能够区分参考方法检测限以上和以下的样品，针对所有五类产毒藻。交叉验证准确率对于AST和PST产毒藻达到0.98，对于DST、AZT和YTX产毒藻为0.87–0.90。NIR-HSI在AST、PST和DST类群中表现出优于FT-MIR光谱法的性能。此外，NIR-HSI在Dinophysis属内实现了物种水平的区分，对于D. ovum的准确率高达0.98。结果表明，NIR-HSI能够在生态相关丰度下检测产毒微藻，并作为有害藻华（HAB）监测计划的筛查技术具有巨大潜力。
**基于近红外高光谱成像的产毒微藻快速检测研究解读**
**研究背景与意义**
有害藻华（HABs）在全球范围内的发生频率、时空分布呈持续增加趋势，这一现象与气候变化和人为活动密切相关。全球变暖导致水温上升，显著延长了产毒微藻的最佳生长周期；沿海区域的人类活动如营养盐排放和水循环动力学改变亦可能促进浮游植物增殖。有害藻华对海洋生态系统造成严重影响，包括生物量积累导致的氧气耗竭以及某些物种产生的藻毒素。藻毒素可导致海洋动物死亡，并在双壳类软体动物等生物体内富集，人类摄食后可能致病甚至死亡。因此，有害藻华不仅是公共健康威胁，还会对水产养殖、贝类捕捞和旅游业造成严重的经济损失，欧盟年损失估计达9至12亿美元。
目前，产毒微藻的分类鉴定和计数主要依赖Uterm?hl倒置显微镜法，该方法耗时且需要高度专业化的操作人员。由于浮游植物多样性高，即使经验丰富的操作者也难以通过经典形态学分类法准确识别有毒藻类。一些形态相似的有毒和无毒藻类只能通过电子显微镜或分子技术加以明确区分，而电子显微镜样品制备步骤繁琐、耗时约两天且需要专门技术培训。基于分子工具的替代技术包括抗体法（如ELISA、免疫荧光）和核酸法（如FISH、SHA、条形码、PCR等），尽管特异性和灵敏度高，但在常规监测中的实施仍面临限制，包括需要并行或多重检测以及分析时间较长等问题。
在此背景下，研究人员探索了近红外高光谱成像（NIR-HSI）作为快速筛查工具的可行性。高光谱成像结合了光谱和空间信息，能够研究样品内部化学组分的空间分布。与紫外-可见光谱相比，红外光谱包含更丰富的官能团和分子结构特征信息，可能提高在低浓度下检测有毒物种的灵敏度。然而，由于水在红外区域的高吸收特性，无法进行遥感成像，必须在过滤后的水样上进行测量。本研究的总体目标是将NIR-HSI开发为一种快速、无需试剂的筛查工具，用于检测含有复杂浮游植物群落的天然海水样品中的产毒微藻。
**研究内容概述**
本研究在葡萄牙西海岸的Ria de Aveiro潟湖开展，该潟湖是伊比利亚大西洋沿岸受有毒藻华影响最严重的沿海系统之一。研究人员于2020年5月26日至2021年6月17日期间，在葡萄牙海洋与大气研究所（IPMA）监测计划的两个站点（RIAV1和RIAV2）采集了63个海水样品。采样频率在春季-夏季高浮游植物生产力期为每周一次，秋季-冬季低产期为每两至三周一次。本研究旨在评估NIR-HSI结合多元图像分析能否区分参考方法检测限以上的样品，涵盖伊比利亚大西洋沿岸监测的五类主要产毒类群（AST、PST、DST、YTX和AZT），并测试Dinophysis属内物种水平和Pseudo-nitzschia属内尺寸类群的区分能力。
**主要关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：利用Uterm?hl倒置显微镜法对样品进行浮游植物分类鉴定和细胞计数，作为参考方法，检测限为RIAV1每升20个细胞、RIAV2每升40个细胞；使用推扫式高光谱成像系统（Specim Fx17相机，光谱范围900–1700 nm）记录过滤海水样品的近红外高光谱图像（950–1690 nm范围，210个波段），经过空间裁剪、光谱裁剪、吸光度转换、Savitzky-Golay平滑和二阶导数处理以及SNV归一化等预处理步骤；采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）建立分类模型，通过留一法交叉验证进行模型验证，并使用区间偏最小二乘方法进行变量选择，以F1分数作为模型优化标准；同时采集傅里叶变换中红外光谱（FT-MIR）作为对比方法。
**研究结果**
**3.1 Ria de Aveiro的产毒微藻物种**
研究人员通过为期一年的采样覆盖了该潟湖浮游植物群落的季节性变化。参考分析结果显示，DST产毒藻是最丰富的类群，在大多数样品中存在，并在20个样品中超过了预警阈值。PST和AST产毒藻的爆发发生在春末夏初，分别有11个和1个样品超过预警阈值。YTX和AZT产毒藻在多个样品中被识别，但细胞计数未达到预警阈值。RIAV1站点的有毒物种丰度和检出频率普遍高于RIAV2。数据集中各类群细胞计数之间的Spearman相关系数最高仅为0.36，表明不同产毒类群间的丰度不存在显著共变，可以独立建立分类模型。数据集中存在高度类别不平衡现象，大多数样品低于检测限，但有少数样品细胞丰度极高。
**3.2 光谱预处理与探索性分析**
原始获得的图像，宽度为640像素、高度为370至500像素不等，单个光谱覆盖935至1720 nm波长范围。研究人员对所有图像进行了目视检查，去除了存在明显伪影或光照问题的图像，最终数据集包含57张图像。预处理后的光谱通过主成分分析（PCA）得分图识别出两个严重异常值并将其排除，最终数据集包含52个样品。预处理程序有效消除了散射效应和不均匀强度的问题。
**3.3 产毒浮游植物类群的判别**
研究人员通过比较平均光谱和单像素光谱两种特征提取方法，发现两者性能相似，最终选择使用平均图像光谱进行建模，因为该方法能够简化预处理流程并显著降低计算时间。针对五类产毒藻（AST、PST、DST、YTX和AZT）分别建立了PLS-DA分类模型。由于部分类群（特别是DST和PST）的类别高度不平衡，无法将数据集划分为校正集和测试集，因此采用完整交叉验证进行模型评估，并通过随机化检验确认模型质量和最优成分数量的选择。AST和PST产毒藻的预测准确率达到0.98，仅出现一个假阴性和一个假阳性。DST、AZT和YTX产毒藻的预测准确率较低，在0.87至0.90之间，但这些类群的数据集存在严重不平衡。变量选择结果显示，不同类群模型的判别变量主要反映微藻细胞壁的化学组成。AST模型的变量集中在1000–1050 nm区域，对应碳水化合物的CH和OH伸缩振动以及蛋白质的NH伸缩振动，这与Pseudo-nitzschia属硅藻的二氧化硅壳表面覆盖多糖和蛋白质层一致。PST模型的变量分布在整个光谱范围（950–1650 nm），反映了产毒甲藻的化学多样性，包括蛋白质和多糖相关波段以及芳香族化合物的贡献。DST、AZT和YTX产毒藻均为甲藻，模型变量主要与纤维素多糖相关的CH和OH伸缩振动有关。与FT-MIR光谱法对比，HSI在AST、PST和DST类群的预测准确率更高，但FT-MIR对AZT类群表现出更高的灵敏度。物种水平判别模型方面，五种Dinophysis属物种的分类模型均表现出高特异性。D. acuta的准确率最高达到0.92，D. ovum和D. rotundata由于阳性样品数量极少，灵敏度和F1分数较低。两类Pseudo-nitzschia尺寸类群的准确率分别为0.83和0.92。
**讨论与结论总结**
在讨论部分，研究人员指出天然海水样品中可能存在非靶标浮游植物、藻类、细菌、碎屑和悬浮颗粒等与靶标产毒藻共变的成分，因此分类模型的检测能力可能部分来自生态代理信号。然而，多种产毒类群在全年四个季节均有检出的事实表明模型能够泛化到不同背景群落；此外，低丰度样品大多被正确分类，进一步支持了模型主要基于物种特异性信号而非简单的生物量响应。研究结论部分指出，这项工作首次在完整的年度沿海监测数据集上证明了NIR-HSI能够在复杂的天然浮游植物群落中以高准确率检测多种产毒微藻类群。该方法对AST和PST产毒藻表现尤为出色，对低频出现的AZT和YTX产毒藻也显示出良好性能。NIR-HSI不依赖色素特征或藻华引起的颜色变化，即使有毒物种在群落中不占优势也能实现检测。与经典显微镜法相比，NIR-HSI速度更快、劳动强度更低，可通过机器学习方法实现自动化；与分子检测方法相比，无需试剂且天然具备多重检测能力。尽管该技术尚不能替代分类学鉴定，但可作为早期预警和筛查工具，帮助实验室优先安排需要详细分析的样品。未来工作应聚焦于扩大样本量、整合基于图像的特征提取和深度学习、将NIR-HSI与微流控或原位采样技术结合，以推动有害藻华业务化早期预警系统的发展。该研究发表在《Marine Environmental Research》。
