DHCR24通过ENKUR/Ca2+信号减轻衰老血管内皮细胞DNA损伤

《Aging Cell》：DHCR24 Alleviates DNA Damage in Senescent Vascular Endothelial Cells via ENKUR/Ca2+ Signaling

　　

DNA损伤被认为是衰老的主要诱因之一。DHCR24是一种定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）的多功能酶，与DNA损伤密切相关。研究人员前期研究表明，DHCR24可延缓血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）衰老。然而，DHCR24与ECs衰老过程中DNA损伤之间的关系仍需进一步探究。在此，研究人员证明，在人类脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）和小鼠肺微血管内皮细胞（mouse pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs）中，衰老可激活ATM介导的DNA损伤反应（DNA damage response, DDR），并下调DHCR24表达。在年轻HUVECs中敲低DHCR24可诱导ATM介导的DDR激活，这一现象在内皮特异性DHCR24敲除小鼠的PMVECs中得到证实。一致地，RNA测序（RNA-seq）结果表明DHCR24对细胞周期调控至关重要。进一步研究表明，复制性衰老HUVECs和DHCR24敲除的年轻HUVECs均表现出内质网应激和线粒体功能障碍，这可能归因于DHCR24缺乏导致的钙超载。在该病理过程中，DHCR24缺乏诱导的ENKUR上调显著加剧钙超载。相反，敲低ENKUR不仅缓解了DHCR24抑制引起的内质网应激和线粒体功能障碍，还抑制了ATM介导的DDR。此外，DHCR24过表达可降低升高的ENKUR水平，同时减轻多柔比星（doxorubicin, DOX）诱导的HUVECs钙超载。综上，这些发现将DHCR24-ENKUR依赖性Ca²⁺信号确认为连接内质网-线粒体稳态与内皮DNA损伤及衰老的机制。因此，恢复DHCR24功能或通过该通路调节钙信号转导，可能具有延缓血管ECs衰老和预防年龄相关疾病的治疗潜力。

DHCR24通过ENKUR/Ca²⁺信号减轻衰老血管内皮细胞DNA损伤的研究解读

一、研究背景与目的

衰老是心血管疾病的主要危险因素，血管内皮细胞衰老导致内皮功能障碍，进而引发多种年龄相关疾病。DNA损伤被认为是衰老的重要驱动因素之一。DHCR24是定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）的多功能酶，先前研究表明其可通过激活Caveolin-1/ERK信号轴抑制活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成，从而延缓血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）衰老。然而，DHCR24在ECs衰老过程中是否直接参与DNA损伤调控及其具体机制尚不清楚。钙信号是调节细胞增殖、迁移和凋亡的关键第二信使，内质网钙超载可诱导线粒体功能障碍和ROS过量产生。ENKUR是瞬时受体电位阳离子通道（transient receptor potential canonical, TRPC）的相互作用蛋白，可能参与细胞内钙稳态调节。本研究旨在探究DHCR24是否通过ENKUR/Ca²⁺信号通路调控血管内皮细胞衰老中的DNA损伤，从而揭示血管衰老的新机制。

二、研究内容与意义

研究人员利用复制性衰老HUVECs、自然衰老小鼠、多柔比星（doxorubicin, DOX）诱导的早衰模型以及内皮特异性DHCR24敲除小鼠等模型系统，发现衰老过程中ATM介导的DNA损伤反应（DNA damage response, DDR）被激活，同时DHCR24表达下调。功能实验表明，DHCR24敲低可诱导ATM介导的DDR和细胞周期阻滞，而过表达DHCR24则减轻DNA损伤并缓解细胞衰老。机制研究进一步揭示，DHCR24缺乏导致ENKUR表达上调，引发细胞内Ca²⁺超载，进而造成内质网应激和线粒体功能障碍，最终激活ATM介导的DDR。该研究确立了DHCR24-ENKUR-Ca²⁺轴作为连接内质网-线粒体稳态与内皮DNA损伤及衰老的关键机制，为延缓血管衰老和防治年龄相关心血管疾病提供了新的潜在干预靶点。该论文发表在《Aging Cell》。

三、关键技术与方法

研究使用了原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs，来自3条不同人脐带）和小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs，来自年轻3月龄和年老14月龄小鼠），以及内皮特异性DHCR24敲除小鼠（DHCR24^flox/flox-Tie2Cre⁺）及其对照。主要技术方法包括：Western blot、免疫荧光、SA-β-gal染色、Edu掺入实验、流式细胞术检测细胞周期；siRNA敲低和慢病毒介导的DHCR24过表达；RNA-seq转录组测序及KEGG富集分析；Fluo4-AM钙成像结合EGTA和毒胡萝卜素处理检测内质网钙库及钙释放；透射电镜观察细胞器超微结构；JC-1探针检测线粒体膜电位，MitoSOX Red检测线粒体ROS；ATP含量测定等。

四、研究结果

（1）DHCR24在ATM介导的DNA损伤反应中下调

通过Western blot和8-OHdG免疫荧光染色，在复制性衰老HUVECs（P13）和老龄小鼠（14月龄）PMVECs及主动脉组织中观察到γH2AX和p-ATM水平升高，同时DHCR24表达下调。在DOX诱导的早衰HUVECs中也观察到同样的变化模式，表明衰老可激活ATM介导的DDR并伴随DHCR24下调。

（2）DHCR24敲低诱导ATM介导的DNA损伤反应

在年轻HUVECs中通过siRNA敲低DHCR24，γH2AX和p-ATM水平显著增加。内皮特异性DHCR24敲除小鼠来源的PMVECs及主动脉组织中同样检测到γH2AX和p-ATM升高。RNA-seq和KEGG分析显示DHCR24功能与细胞周期调控密切相关，敲低DHCR24导致CDK1、CyclinA2、CyclinB1等周期蛋白表达下调，细胞周期阻滞于G2期。

（3）DHCR24过表达减轻ECs DNA损伤和衰老

在衰老HUVECs（P13）中过表达DHCR24可显著降低γH2AX和p-ATM水平。在DOX诱导的早衰模型中，DHCR24过表达减少γH2AX焦点形成，抑制p53和ATM磷酸化，改善DOX引起的G2期细胞周期阻滞，恢复CDK1、CyclinA2和CyclinB1表达，同时降低ROS水平并减轻细胞衰老。

（4）DHCR24缺乏促进衰老ECs的内质网应激和线粒体损伤

在复制性衰老HUVECs和PMVECs以及DHCR24敲低细胞和内皮特异性敲除小鼠中，p-IRE1/IRE1比值、VDAC和MCU蛋白水平升高，OPA1表达降低，提示内质网应激和线粒体功能障碍被诱导。透射电镜观察发现DHCR24敲低细胞及DHCR24敲除小鼠主动脉内皮中线粒体肿胀、嵴断裂、内质网囊泡扩张。JC-1染色显示线粒体膜电位降低，MitoSOX Red荧光增强指示线粒体ROS过度产生。

（5）DHCR24调控衰老ECs中的钙超载

利用Fluo4-AM探针检测发现，复制性衰老HUVECs和DHCR24敲低细胞中细胞内Ca²⁺浓度显著升高，内质网Ca²⁺水平也增加，同时SOCE被激活。在DOX诱导的早衰HUVECs中，DHCR24过表达可显著逆转DOX引起的内质网Ca²⁺升高。

（6）ENKUR介导DHCR24缺乏诱导的内皮钙超载

RNA-seq结果显示DHCR24敲低后ENKUR表达显著上调，qPCR进一步验证。在DHCR24和ENKUR双敲低细胞中，细胞内Ca²⁺水平、ER应激标志物（p-IRE1）、线粒体相关蛋白（VDAC、MCU）以及p-ATM和γH2AX水平均较单独敲低DHCR24组显著降低。放线菌素D追踪实验表明，DHCR24敲低使ENKUR mRNA降解速率减慢，即增加了其稳定性。DHCR24过表达则可降低DOX诱导的ENKUR mRNA高表达。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究将DHCR24的功能从经典的胆固醇合成角色拓展至对内皮细胞衰老和基因组稳定性的保护作用。研究证实，DHCR24通过促进ENKUR mRNA降解维持胞内Ca²⁺稳态，从而抑制内质网应激和线粒体功能障碍，最终减少ATM介导的DNA损伤。研究局限性在于：未直接评估DHCR24过表达对DOX诱导后内质网和线粒体功能形态的影响；所有机制实验均在内皮模型中进行，尚不清楚DHCR24-ENKUR/Ca²⁺轴是否具有内皮细胞特异性，或是否也存在于其他衰老细胞类型中。

研究结论可概括为：DHCR24通过调节ENKUR依赖性Ca²⁺稳态，维持内质网和线粒体功能，保护血管内皮细胞免受DNA损伤和衰老，为预防DNA损伤相关衰老及年龄相关疾病提供了新的理论依据和潜在干预策略。