产萝卜硫素的副干酪乳杆菌CCFM1221联合西兰花种子提取物改善脂多糖处理小鼠的保肝作用

《Food Science & Nutrition》：Sulforaphane-Producing Lacticaseibacillus paracaseiCCFM1221 Combining Broccoli Seed Extract Improved the Hepatoprotective Effect on Lipopolysaccharide-Treated Mice

　　

本研究旨在探讨产萝卜硫素的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CCFM1221对西兰花种子提取物(broccoli seed extract, BSE)在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理小鼠中保肝功效的影响。结果表明，L. paracasei CCFM1221对萝卜硫苷(glucoraphanin)表现出高代谢能力。L. paracasei CCFM1221与BSE联合给药可通过抑制TLR4/NF-κB通路并激活Nrf2通路，改善肝脏指数、血清生化指标和肝脏炎症细胞因子。与单独使用BSE相比，联合干预显著抑制了丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、白细胞介素(interleukin, IL-1β)和MDA水平的升高。此外，与单独BSE干预相比，L. paracasei CCFM1221与BSE联合使结肠萝卜硫素水平从195.63?±?29.60 nmol/g提升至265.70?±?34.29 nmol/g。同时，它提高了短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)产生菌的丰度，并促进了萝卜硫素产生菌的生长。这些发现表明，益生菌可增强天然产物的活性，从而增强其药理作用。

**论文解读：产萝卜硫素益生菌联合西兰花种子提取物对脂多糖诱导小鼠急性肝损伤的保肝作用及机制研究**

**一、研究背景与问题**

急性肝损伤（acute liver injury, ALI）是一种起病急骤、死亡率超过50%的危重疾病，其常见诱因包括药物过量、缺血再灌注等。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁成分，常被用于构建ALI动物模型，因其能激活炎症反应、抑制抗氧化酶活性，加速肝损伤进展。目前临床治疗ALI的药物存在长期服用不良反应多的问题，因此寻找安全有效的天然活性物质成为迫切需求。西兰花种子提取物（broccoli seed extract, BSE）富含萝卜硫苷（glucoraphanin），后者可在肠道菌群作用下转化为萝卜硫素（sulforaphane），后者具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性。然而，萝卜硫苷向萝卜硫素的转化效率存在显著个体差异，与肠道菌群组成密切相关。先前研究已初步证明BSE可改善肝损伤，且研究人员从发酵食品中分离出一株副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）CCFM1221，该菌株在体外具有显著促进萝卜硫素生成的能力。基于此，研究人员假设L. paracasei CCFM1221可通过促进体内萝卜硫苷向萝卜硫素的生物转化，增强BSE的保肝作用。为验证这一假设，本研究建立了LPS诱导的急性肝损伤小鼠模型，系统评估了BSE单独或联合L. paracasei CCFM1221对炎症反应、氧化应激、相关基因表达及肠道菌群组成的影响，旨在阐明该益生菌菌株增强天然产物保肝功效的关键作用及潜在微生物机制。该论文发表在《Food Science》。

**二、主要技术方法**

研究人员采用LPS（5 mg/kg）腹腔注射构建C57Bl/6小鼠（雄性，7周龄，来源：SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.）急性肝损伤模型，分为对照组、模型组、BSE组（370 mg/kg/day）、CCFM1221组（10⁹ CFU/day）及BSE+CCFM1221联合组，干预14天后进行LPS处理。使用超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱（UHPLC Q Exactive MS）检测结肠内容物中萝卜硫苷和萝卜硫素含量；采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、ALP活性；通过商业试剂盒测定肝脏组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平及MDA、SOD、CAT、GSH-Px活性；进行肝脏苏木精-伊红（H&E）染色和结肠阿尔新蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色；采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测肝脏TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、IK-Bα、AhR、Arg1、Nrf2的mRNA表达，并进行免疫荧光分析；利用16S rRNA基因（V3-V4区）测序（Illumina Miseq PE300平台）分析肠道菌群组成，并通过主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及线性判别分析效应大小（LEfSe）进行差异菌群鉴定。

**三、研究结果**

**3.1 BSE和L. paracasei CCFM1221对体重、能量摄入和肝脏指数的影响**
通过每日监测体重及摄食饮水量，结果显示各组小鼠体重稳步增长，最终体重及摄食饮水量无显著差异（p>0.05）。与对照组相比，LPS处理显著升高肝脏指数（p<0.05），单独BSE或CCFM1221干预虽略微降低但未达显著水平（p>0.05），而BSE与CCFM1221联合干预则显著逆转了LPS诱导的肝脏指数升高（p<0.05）。

**3.2 L. paracasei CCFM1221促进BSE对ALI小鼠的保肝作用**
通过检测血清ALT、AST、ALP活性及肝脏H&E染色，发现LPS处理显著升高上述血清指标（p<0.05），表明模型建立成功。与模型组相比，CCFM1221组仅显著降低AST活性（p<0.05），而对ALT、ALP无显著影响；BSE组及BSE+CCFM1221组则显著降低ALT、AST、ALP活性（p<0.05），其中联合组效果最为显著。H&E染色显示，模型组出现中央静脉扩大、肝细胞肿胀、凋亡、炎症浸润及出血；BSE、CCFM1221及其联合干预均不同程度改善上述病理变化，其中联合组肝细胞及肝索病变恢复明显，坏死和炎症浸润减少。

**3.3 L. paracasei CCFM1221增强BSE在ALI小鼠中的抗炎作用**
通过检测肝脏炎症细胞因子，结果显示模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，IL-10水平显著降低（p<0.05）。单独CCFM1221对LPS诱导的炎症因子变化无显著抑制作用（p>0.05）；BSE干预显著抑制TNF-α和IL-6升高（p<0.05），但对IL-1β和IL-10无显著影响；而BSE+CCFM1221联合干预显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，同时显著升高IL-10水平（p<0.05），表明联合干预的抗炎效果优于单独干预。

**3.4 L. paracasei CCFM1221增强BSE在ALI小鼠中的抗氧化作用**
通过检测肝脏MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平，发现模型组MDA显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低（p<0.05）。与模型组相比，BSE组和BSE+CCFM1221组MDA显著降低（p<0.05），其中BSE+CCFM1221组MDA从0.64±0.10降至0.37±0.13 nmol/mg蛋白；BSE组仅显著提高CAT活性（p<0.05），而对SOD、GSH-Px无显著影响；CCFM1221组对各抗氧化指标均无显著影响；而BSE+CCFM1221联合干预则显著逆转LPS诱导的SOD、GSH-Px、CAT活性降低（p<0.05），表明联合干预有效缓解异常氧化应激。

**3.5 L. paracasei CCFM1221促进BSE对基因mRNA表达的调节作用**
通过RT-qPCR检测肝脏基因表达，发现模型组TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS mRNA表达显著上调，IK-Bα、AhR、Arg1、Nrf2显著下调（p<0.05）。BSE干预显著下调TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS并上调IK-Bα、Arg1（p<0.05），但对AhR、Nrf2无显著影响；CCFM1221干预显著改变TLR4、IK-Bα、iNOS表达（p<0.05）；而BSE+CCFM1221联合干预显著逆转LPS诱导的所有上述基因变化（p<0.05）。免疫荧光分析进一步证实，LPS处理降低Arg1和Nrf2表达、增加iNOS表达，而联合及单独干预均不同程度缓解这些变化。

**3.6 L. paracasei CCFM1221促进ALI小鼠体内萝卜硫苷的转化**
通过检测结肠内容物中萝卜硫素含量，发现对照组、模型组及CCFM1221组小鼠肠道中未检测到萝卜硫素；BSE组结肠萝卜硫素含量为195.63±29.60 nmol/g；而BSE+CCFM1221组含量显著升高至265.70±34.29 nmol/g（p<0.05），表明L. paracasei CCFM1221有效促进结肠中萝卜硫苷的转化。

**3.7 BSE和L. paracasei CCFM1221对ALI小鼠肠道菌群的影响**
通过16S rDNA测序分析，各组间Chao1、Shannon、Simpson指数无显著差异（p>0.05）。在门水平，BSE组较模型组略增加变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）等相对丰度，略降低拟杆菌门（Bacteroidetes）；BSE+CCFM1221组则略降低拟杆菌门、变形菌门等，略增加放线菌门和软壁菌门（Tenericutes）。PCA和PLS-DA分析显示，BSE组及BSE+CCFM1221组与模型组明显分离，表明肠道菌群结构发生显著改变。LEfSe分析鉴定出各组优势菌属：BSE组富集Faecalibaculum、Eubacterium_ruminantium group、Eubacterium_coprostanoligenes group、Prevotellaceae NK3B31 group、Corynebacterium、Butyricicoccus等；BSE+CCFM1221组则富集Coriobacteriaceae_UCG-002、Turicibacter、Eubacterium_fissicatena group、Parvibacter、Adlercreutzia、Ruminococcus_1等，其中Eubacterium_fissicatena group丰度增加有助于提升结肠萝卜硫素水平。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次证明产萝卜硫素的益生菌菌株L. paracasei CCFM1221与BSE联合干预可通过双重调节TLR4/NF-κB炎症通路和Nrf2抗氧化通路，显著增强BSE的保肝作用，同时揭示了肠道菌群重构的双重功能：既富集短链脂肪酸产生菌，又促进萝卜硫素转化菌群生长。研究人员还指出，血清ALT、AST、ALP是评估肝损伤严重程度的临床生物标志物，联合干预显著降低这些指标；LPS通过激活TLR4/MyD88/NF-κB通路促进炎症因子产生，而联合干预通过上调IK-Bα和Arg1、下调iNOS等抑制该通路；氧化应激方面，联合干预通过提高SOD、GSH-Px、CAT活性并降低MDA，激活Nrf2通路实现保护作用。此外，肠道菌群分析表明，BSE组富集的SCFA产生菌可能源于BSE中的多糖，而BSE+CCFM1221组富集的菌群如Eubacterium_fissicatena group与萝卜硫素水平升高相关，进一步支持了益生菌促进萝卜硫苷转化的假设。

**结论翻译**：综上所述，本研究表明，L. paracasei CCFM1221通过提高萝卜硫苷向萝卜硫素的生物转化，增强了BSE对LPS处理小鼠的保肝作用。这主要表现为通过调节TLR4/NF-κB和Nrf2通路，预防炎症反应和氧化应激。此外，研究发现BSE与L. paracasei CCFM1221联合干预不仅增加了SCFA产生菌的丰度，还促进了萝卜硫素产生菌的生长。总之，这些数据为提高膳食植物化学物质生物活性提供了一种新方法。