《Journal of Inherited Metabolic Disease》：From Single Cells to Diagnosis: Proteomics Technologies in the Multi-Omics Landscape of Rare and Mitochondrial Diseases
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基于质谱的蛋白质组学已迅速从一种小众方法发展为标准工具。近十年的单细胞蛋白质组学发展轨迹为疾病研究开辟了新的生物学维度。线粒体疾病具有显著的细胞间异质性，特别适用于这些方法。在此，研究人员讨论了该方法如何作为罕见病诊断的正交功能层。研究人员追溯了罕见病诊断从生
基于质谱的蛋白质组学已迅速从一种小众方法发展为标准工具。近十年的单细胞蛋白质组学发展轨迹为疾病研究开辟了新的生物学维度。线粒体疾病具有显著的细胞间异质性，特别适用于这些方法。在此，研究人员讨论了该方法如何作为罕见病诊断的正交功能层。研究人员追溯了罕见病诊断从生化酶学检测到基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的演变，强调了各个组学层及其整合带来的诊断率逐步提高。研究人员讨论了批量方法在捕获遗传扰动的功能后果方面的局限性、单细胞测量带来的新机遇，以及空间单细胞蛋白质组学如何进一步丰富诊断组织中受累细胞的生物学信号。研究人员观察到，持续存在的诊断缺口不仅反映技术限制，而且日益反映数据共享和基础设施方面的挑战，以及功能分子证据的解释框架。在此背景下，研究人员考虑了人工智能的机遇和单细胞蛋白质组学在罕见病诊断中的伦理维度。最后，研究人员提出了一个用于具有细胞间变异性的罕见病临床诊断的单细胞深度视觉蛋白质组学（scDVP）框架，并论证线粒体疾病是理想的概念验证模型。
1 罕见病领域的诊断缺口（The Diagnostic Gap in the Rare Disease Field）
基因组测序现已能够识别人类基因组中的大多数变异，然而某一变异是否解释患者表型是完全不同的问题。即使经过全面基因组调查，仍有45%–65%的临床疑似病例未获解决。这一缺口在快速技术进步的背景下依然存在，并受到罕见病领域现实和临床常规局限性的影响。约80%的罕见病负担可归因于约150种疾病，其余超过10000种疾病的诊断率可能最低，且基因型相似的患者全球仅有少数。这导致缺乏特征明确的参考队列，尤其是对于临床非典型或多因素表型患者。各国罕见遗传病诊断标准差异很大，患者能否到达正确的国家或地方参考中心，以及新方法能否惠及患者，取决于法律框架、伦理指南和成本效益标准的协调。这种转化过程需要大型国家和国际倡议的协同努力。未解决病例中，功能层和技术发展最为迫切，诊断缺口的临床后果也最为严重。罕见病影响3%–6%的人群，即使保守估计，20%–30%的未解决比例也意味着全球超过5000万个体缺乏分子诊断。分子诊断通过提供疾病管理和遗传咨询信息，减轻患者和家庭诊断之旅的心理负担，并为治疗靶点发现奠定机制基础。
2 线粒体疾病作为罕见病诊断复杂性的模型（Mitochondrial Disease as a Model for Rare Disease Diagnostic Complexity）
线粒体疾病是最常见的先天性代谢错误（IEM）之一，集中体现了上述诊断挑战。其患病率估计为每100000人中23例，最低出生患病率为每100000活产中至少6.2例。病理通常源于氧化磷酸化（OXPHOS）功能障碍，但潜在疾病机制多样。这些疾病可由线粒体DNA（mtDNA，成人患病率每100000人中20例）或核DNA（nDNA，成人患病率每100000人中2.9例）中负责线粒体功能、维持或生物发生的基因变异引起。MitoCarta 3.0基因目录编录了超过1100个人类线粒体蛋白，其中13个由mtDNA编码。迄今已有超过350个核基因与人类线粒体疾病相关，但真实数字可能更高。线粒体疾病的遗传复杂性还因mtDNA异质性现象而加剧，即同一细胞内野生型和突变型mtDNA分子共存。在mtDNA疾病中，异质性水平在不同组织、细胞类型甚至时间上均有差异，并与mtDNA拷贝数共同影响疾病负担。在诊断相关的骨骼肌活检中，这表现为OXPHOS缺陷纤维和组织化学正常纤维镶嵌，对传统的基于单样本的诊断工作流程构成根本性挑战。
3 方法问题（A Matter of Methods）
基于质谱的蛋白质组学直接、无偏地测量遗传扰动的蛋白质水平后果，叠加在其他组学层之上。单细胞分辨率可以克服传统方法中单一静态遗传快照过于僵硬而无法进行精确机制诊断的缺点。虽然线粒体疾病通过遗传性细胞间异质性体现了诊断挑战，但诊断原则可扩展到大多数罕见病类别，其中组织活检引入了正交功能层。
3.1 前组学诊断工具（The Pre-Omics Diagnostic Toolkit）
罕见病诊断，尤其是IEM诊断，建立在组织化学、酶生化和靶向测序方法的基础上。在线粒体诊断中，骨骼肌活检的组织化学染色，包括细胞色素c氧化酶（COX）和琥珀酸脱氢酶（SDH）染色，可在单纤维水平可视化OXPHOS功能障碍。此外，批量组织匀浆中呼吸链酶活性的生化测量提供了复合物特异性缺陷的定量功能证据。对于其他IEM，血液、成纤维细胞或白细胞中的靶向酶活性测量可诊断溶酶体贮积症、糖原贮积病和脂肪酸氧化缺陷。直接功能测量提供了仅基于序列的方法无法提供的诊断信息。在基因水平上，核型和染色体微阵列建立了检测大结构变异和拷贝数变化的诊断框架，染色体微阵列至今仍是发育迟缓和先天异常的一线检测手段。
3.2 罕见病诊断中的测序时代（The Sequencing Era in Rare Disease Diagnostics）
以基因面板为中心的短读长全基因组测序（srWGS）和全外显子组测序（WES）是当前广泛临床罕见病诊断的一线方法。srWGS相比WES具有4%–10%的诊断率优势，且成本效益分析在多个卫生系统中支持srWGS，因其缩短了确诊时间。最先进的srWGS基因面板方法在高怀疑异质性研究队列中达到30%–35%的诊断率。然而，这取决于表型特异性、面板设计和队列组成：在线粒体疾病中，仅限于已知线粒体疾病基因的窄基因面板诊断率仅为9%–16%，这主要是因为无法识别30%–60%由非线粒体病因产生重叠表型的病例。更广泛的IEM基因面板或全基因组方法的诊断率为30%–37%。对于一般罕见病，常规临床实践中以基因面板为中心的WGS诊断率为20%–25%，显著低于多数研究。全基因组分析扩大了搜索范围，但增加了偶然发现负担、解读时间和计算成本。三人分析可减少变异解读时间并将诊断率提高达9%。在表型重叠的临床情况下，推荐基因面板而非全基因组srWGS作为一线方法，以避免错误遗传诊断。对初始阴性WES或WGS的全基因组重分析可产生10%–25%的额外诊断。整合功能验证（如美国未诊断疾病网络UDN）可将诊断率提高至35%。这些倡议凸显了研究工作密集型综合研究级方法与标准临床诊断工作流程之间的差距。
3.3 长读长测序作为补充方法和srWGS竞争者（Long-Read Sequencing as Complementary Approach and srWGS Contender）
srWGS在检测复杂结构变异、重复序列或高GC区域变异方面存在固有局限，对深层内含子变异的解读能力有限。新一代长读长WGS（lrWGS）解决了许多盲点，能够精确解析结构变异、短串联重复（STR）大小、复合杂合变异分相和表观遗传分析。临床研究报告lrWGS可在srWGS未诊断的患者中识别7%–18%的致病变异。随着测序化学和仪器进展，lrWGS正越来越多地被讨论为srWGS的潜在继任者而非补充工具。
3.4 转录组测序在罕见病诊断中的应用（Transcriptome Sequencing in Rare Disease Diagnostics）
RNA测序（RNA-seq）可检测三类srWGS无法直接测量的发现：异常剪接、反映单倍剂量不足或双等位基因功能丧失的表达异常，以及单等位基因表达失衡。约15%的致病变异预计影响mRNA剪接，其中相当比例位于非经典剪接位点。血液或成纤维细胞转录组学在异质性队列中报告诊断率提高7%–17%。对受累组织进行测序可使诊断率几乎翻倍，但受组织可及性限制。成纤维细胞约表达60%–72%的孟德尔疾病基因，线粒体疾病基因超过90%，但许多罕见神经疾病的致病基因主要在脑组织中表达。在骨骼肌中，RNA-seq在WES阴性的疑似孟德尔肌病患者中识别出约35%的分子诊断。深度学习剪接预测器（如SpliceAI）和异常剪接检测方法（如FRASER）及表达异常检测方法（如OUTRIDER）已成为解读非编码变异和优先排序候选基因的重要工具。定量RNA-seq常被用作蛋白质水平的预测指标，但其生物学准确性高度依赖于亚细胞区室，中位Pearson R
2约0.26。特别是在线粒体疾病组中，RNA水平对线粒体蛋白（包括OXPHOS和线粒体核糖体蛋白）丰度的预测能力很差。这表明对于以OXPHOS功能障碍为主要致病机制的线粒体疾病诊断，转录组学不能替代直接的蛋白质水平测量。
3.5 蛋白质组学作为罕见病中的正交功能证据（Proteomics as Orthogonal Functional Evidence in Rare Disease）
定量质谱蛋白质组学正从分析研究领域转变为具有临床相关性的诊断竞争者。MS靶向方法要求预定义生物标志物，在高度异质性且难以分类的转诊队列中采用有限。基于亲和力的平台（如Olink邻近延伸分析和SomaScan）可对血浆或血清中数千种蛋白进行可扩展的靶向分析，但依赖于预定义亲和试剂面板且仅适用于体液。非靶向蛋白质组学可无偏地识别蛋白质丰度模式，产生功能假设。在溶酶体贮积症中，蛋白质-脂质组学分析表征了自噬缺陷和继发代谢变化；法布里病的深度血浆蛋白质组学揭示了系统和组织特异性蛋白特征；杜氏肌营养不良的大规模研究识别了与疾病进展相关的生物标志物。一项肌张力障碍患者的大型临床研究表明，MS成纤维细胞蛋白质组学通过候选变异重分类和非靶向异常值分析提高了诊断率。IEM是诊断蛋白质组学整合的概念性合适领域，线粒体疾病研究最为深入。外周血单个核细胞的非靶向MS蛋白质组学在83%分子确诊线粒体疾病患者中提供了功能蛋白质组学证据。成纤维细胞蛋白质组学可提供生化亚型和遗传亚型分类，并在ACMG/AMP变异分类框架下进行意义不明确变异（VUS）重分类。在121例WES阴性孟德尔疾病未诊断队列中，成纤维细胞蛋白质组学与RNA-seq共同促进了21%的分子诊断。尽管已有研究级发现，蛋白质组学特征转化为常规临床诊断仍具挑战。ACMG/AMP框架包含功能证据代码（PS3/BS3），近期共识建议已建立校准方法，但蛋白质组学整合入标准化框架仍在积极发展中。
3.6 代谢组学作为生物学功能障碍的直接读数（Metabolomics as Direct Readout of Biological Dysfunction）
代谢组学是唯一直接测量代谢功能障碍化学表型的组学层。在IEM诊断中，靶向代谢物定量已临床确立，基于串联MS的新生儿筛查和靶向代谢物面板仍是有机酸尿症、脂肪酸氧化障碍和氨基酸代谢缺陷的一线诊断工具。概念验证研究表明，单一非靶向血浆MS分析可在广泛IEM谱中识别特征性模式，非靶向方法已在约100种IEM中显示诊断价值。整合靶向和非靶向代谢组学与基因组数据的框架在IEM队列中显示了高诊断准确性。技术边界目前限制了非靶向方法的临床实用性：人类血浆估计含有超过4600种不同代谢物，当前单平台流程仅能可靠鉴定约1000种，且大多数检测信号尚不能确定归属。代谢物水平快速波动、通量测量复杂和光谱固有复杂性也构成内在局限。蛋白质层和代谢物层紧密相连，蛋白质组学捕获执行机制，代谢组学报告其功能输出。
4 当单一生物学层不够（When One Biological Layer Is Not Enough）
没有单一组学层能捕获罕见病生物学的全部复杂性。基因组学识别候选变异但无法测量功能后果；转录组学捕获基因表达但仅不完全测量蛋白质丰度或活性；蛋白质组学测量功能蛋白质景观但不解决代谢稳态或通量。整合多层已在前瞻性队列中显示附加诊断率，在异质性罕见病人群中，向基因组测序添加功能组学使诊断率提高约7%。当前主要整合策略仍是顺序过滤方法，基因组发现锚定解释，功能组学提供支持或反对证据。跨层冲突信号的权衡框架尚不成熟，多组学管道的前瞻性临床验证有限。顺序多组学方法将基因组学保留为解释守门人，将功能层限制在已存在基因组候选的情况下，恰排除了最需要功能证据的未解决病例。平台如MatchMaker Exchange已开始解决表型-基因匹配问题，将这一模式扩展到功能组学数据将有助于区分真实疾病信号与患者特异性变异、生物和技术噪声及继发补偿反应。另一个平行瓶颈在于结构化临床表型，包括系统使用基于本体的工具（如人类表型本体），否则多组学模式无法在临床诊断中充分锚定。
5 从批量定量到空间分辨率（From Bulk Quantification to Spatial Resolution）
批量定量蛋白质组学的效用受限于对数千个细胞和多种细胞类型信号的平均化，掩盖了定义组织疾病的细胞和空间异质性。特别是在mtDNA变异引起的线粒体疾病中，异质性表型因此被掩盖。组织均质化还丢失了细胞间相互作用、患病细胞与健康细胞之间的旁分泌信号以及微环境对蛋白质表达的影响。单细胞分辨率可提供批量测量无法获取的信息。在单细胞水平解析蛋白质丰度可富集来自表型受累细胞的生物学信号，内在提高统计功效。同时，测量单个活检中的多种细胞状态可重建空间分离细胞状态的时间疾病轨迹。基于抗体的免疫荧光方法，如骨骼肌中OXPHOS复合物四重染色，已证明组织分辨蛋白追踪的诊断价值。LC-MS蛋白质组学和激光显微切割技术的进展将非靶向蛋白质组学扩展到低输入样本，同时保留空间组织背景。深度视觉蛋白质组学（DVP）结合形态学引导的单细胞分离和高灵敏度数据非依赖采集MS（DIA-MS），可在已知至少一个分层标记蛋白的情况下对选定细胞进行无偏、深度蛋白质组分析。DVP可工作至单细胞水平，在10μm厚肝细胞切片中每细胞可鉴定约2700–4300个蛋白。这些能力使DVP，特别是其单细胞分支，成为具有显著细胞间异质性或细胞类型特异性致病性疾病的候选诊断方法。
6 空间单细胞蛋白质组学在线粒体疾病中的概念验证（Spatial Single-Cell Proteomics in Mitochondrial Disease as a Proof-Of-Concept）
研究人员提出了用于线粒体疾病的诊断性单细胞DVP（scDVP）框架，使用骨骼肌活检，这是最具诊断价值的材料。首先，使用新鲜冷冻肌肉横截面的标准组织化学染色评估单纤维水平的呼吸链活性。染色强度用于将纤维沿从组织化学正常到严重缺陷的连续体分层，定义单纤维用于全自动激光显微切割。随后通过DIA和下游无标记定量获取蛋白质组数据。纤维蛋白谱沿基于成像的线粒体功能障碍轨迹排序，生成患者单个活检中线粒体失代偿的伪时间表示。这允许追踪通路水平蛋白质组变化，包括OXPHOS亚基丢失、组装因子耗竭和补偿性通路上调，从早期细微阶段到晚期纤维功能障碍。该方法从横断面活检中提取疾病标志，无需纵向采样。新获得的功能层可用于基因组未解决病例的变异重新优先排序和机制假设生成。最终评估仍由医学专家团队完成（人在环路诊断）。目前公开的DVP数据集显示14种组织27种细胞类型的平均线粒体蛋白质组覆盖率为70%，骨骼肌对OXPHOS亚基蛋白和线粒体编码蛋白显示出更高覆盖率。虽然单纤维水平覆盖尚未系统建立，但预期低于细胞类型分辨的DVP，概念验证数据表明单纤维水平可实现有意义的线粒体蛋白质组深度（>35%）。
7 从概念验证到临床转化（From Proof-of-Concept to Clinical Translation）
靶向MS组织蛋白质组学已在淀粉样变性中实现临床应用，激光显微切割感兴趣区域用于疾病亚型分型。DVP将该原理扩展至单细胞分辨率的无偏蛋白质组范围内分析。在皮肤中，DVP应用于中毒性表皮坏死松解症（TEN）患者归档活检，分别解析角质形成细胞和浸润免疫细胞的蛋白质组，确定JAK/STAT和干扰素信号为主要致病驱动因素，这指导了JAK抑制剂治疗，并与至少七名TEN患者的恢复相关。在肝脏中，DVP应用于α-1抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）活检，解析了肝细胞应激阶段的分子事件，确定早期过氧化物酶体激活为抗纤维化进展的候选保护机制。癌症虽通常不归类为罕见病，但 exemplifies 这一原理：DVP已用于黑色素瘤、结直肠癌和胰腺癌前驱病变，定义疾病进展、免疫逃逸机制和细胞状态间分子转变。相同原理适用于当前诊断方法受细胞异质性或功能分辨率不足限制的组织。除线粒体病外，骨骼肌活检被指南推荐用于炎性肌病亚型分类，但约三分之一的特发性炎性肌病（IIM）病例无法通过活检确认亚型。心脏结节病中，心内膜心肌活检的诊断率仅为25%–38%。细胞类型分辨的蛋白质组分析可在组织学阴性时补充分类。临床实施的实际障碍包括专用仪器成本（完整DVP工作流程估计约200万欧元，包括激光显微切割系统、纳升液相色谱、高分辨质谱仪和样本制备自动化）。通过分析每个活检最多50个单细胞，DVP可提供足够统计功效。当前深度蛋白质组分析通量可达每周840个单细胞（LC受限），允许每台LC-MS每周处理15–20个活检。LC-MS技术历史发展表明未来5年通量至少翻两番。数据存储和生物信息处理是另一项基础设施考虑：每台LC-MS每周产生超过1TB原始数据，需要符合GDPR的访问控制基础设施。光谱库搜索和无标记定量在标准多核工作站上需要数小时，云可部署框架和新兴搜索引擎正在减少计算障碍。若干半自动工具现已可用，DVP管道自主性和可访问性的努力遵循FAIR原则，但尚不存在完整的端到端诊断级管道。
8 AI辅助解释及其边界（AI-Assisted Interpretation and Its Boundaries）
AI技术将从根本上改变高维生物数据集解读。单细胞蛋白质组数据本质上是多变量的，同时测量空间定义细胞群中的数千种蛋白质。机器学习（ML）方法可通过识别共丰度模式、空间梯度和细胞类型特异性特征来利用这些数据，而传统统计分析无法捕获这些。下游组学驱动的疾病分类需要足够规模和多样性的注释数据库，包括参考图谱诊断、异常值标记、候选优先排序和跨组学不一致证据整合。然而，直接从临床标注病例学习的ML方法难以超越这些病例所编码的知识。未解决病例恰是缺乏此类注释信号的病例，尚未以足够规模或生物学细节产生可学习模式。新兴序列到功能模型（如AlphaGenome）通过从实验测量基因表达、染色质可及性和跨细胞类型剪接预测分子后果，扩展了边界，可为诊断未表征的变异（包括深层内含子和调控变异）生成功能假设。AI预测工具涉及数百万加权参数，可解释性方法能识别影响预测的输入特征，但特征重要性不能直接映射到生物学机制。统计上合理但缺乏可验证机制的AI生成推理不符合临床诊断标准。然而，人类诊断推理也依赖模式识别和临床直觉，人类诊断错误率估计为8%–15%。因此，重点应放在开发具有错误模式识别的AI系统，而不要求完全机制透明——人类推理本身也无法提供这种透明。
9 伦理维度（Ethical Dimension）
临床蛋白质组学的伦理指导侧重于敏感和潜在可识别数据的处理、参考数据库的代表性以及诊断益处的公平获取。单细胞蛋白质组学在罕见病中有三个独特特征：第一，组织获取由特定诊断问题指导，而非广泛采样，这倾向于缩小偶然发现表面但并未消除；第二，患者群体极小，超罕见疾病中相似患者可能全球仅有数人；第三，诊断信号是功能性的而非基因型的，这重塑了数据不确定性应如何报告和处理。这些问题相互作用，带来三个问题：深度功能谱中的偶然发现、罕见病诊断的近n-of-one特征以及意义不明确的发现。偶然发现在深度功能分析中是设计使然而非意外。在组织活检背景下，除了“可操作与不可操作”轴外，还出现“近指征与远指征”轴。近指征发现属于原始同意范围，远指征可能不属于。“需要知道”原则常在可操作且严重健康后果时占主导。由于指征患者常为儿童，非靶向方法产生过多可能发现，任何单一同意都无法预见。关于迟发发现和不知情权的决定通常由专家团队根据疾病特定和伦理指南权衡。罕见病诊断的n-of-one特征集中了隐私问题，公开表型加深度蛋白质组谱通常可在无明确标识符的情况下识别患者，因为匿名化取决于在此规模下不存在的人群。标准隐私框架难以解决这一张力。国际功能组学数据共享是缩小诊断缺口的有效杠杆，因为每个新诊断通常依赖于少量先前图谱。意义不明确发现有两种形式：一是遗传学中熟悉的VUS，功能数据有助于解决；二是蛋白质组学特有的统计稳健但机制不可恢复的模式，类似于临床影像中的偶发瘤，可报告为意义不明确并指导随访。这些问题的共同点在于，过度限制或不够明确的指南会阻碍能缩小诊断缺口的研究，而代价不成比例地由服务不足的患者承担。负责任的自我监管，考虑患者和倡导者视角，为领域提供了规则路径。时机应在方法及其临床适应证仍在定义时进行，而非在其固化后。
10 呼吁功能证据（A Call for Functional Evidence）
罕见遗传病的诊断缺口不会仅靠基因组测序关闭。变异检测和解读的改进已显著推动诊断率提升，但剩余未解决病例可从基因组数据无法提供的功能证据中获益。领域已通过开发正交分子方法应对，每种方法测量不同生物学层，证据支持整合额外数据层可提高诊断率。蛋白质组学在蛋白质、蛋白质复合物和通路水平解析功能障碍，位于转录组学和代谢组学证据之间。空间单细胞蛋白质组学通过在细胞组织水平解析功能后果，解决了批量蛋白质组学的不足。线粒体疾病作为概念验证，其遗传复杂性、核-线粒体相互作用和空间异质性组织功能障碍展示了测序单独的局限性和功能证据的互补价值。快速技术进步已将蛋白质组学领域的限制因素从分析深度转向生物学解释和临床整合。技术方面，空间分离、低输入样本制备和通量的进展正汇聚成DVP等工作流程。数据基础设施方面，组织蛋白质组图谱、疾病队列分析、跨祖先参考数据库和标准化报告必须建立，基于参考的诊断和多
