《Theriogenology》：miR-6388 regulates granulosa cell function in sheep by targeting
GDF9 and modulating the TGF-β signaling pathway
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摘要产羔数是绵羊具有重要经济价值的性状，与卵巢卵泡发育和颗粒细胞（GC）功能密切相关。本研究调查了GDF9多态性与产羔数之间的关联，并研究了 miR-6388 对绵羊 GCs 中GDF9的转录后调控作用。变异最初通过对 20 只母羊进行桑格测序鉴定，随后在 377 只 3 岁
摘要
产羔数是绵羊具有重要经济价值的性状，与卵巢卵泡发育和颗粒细胞（GC）功能密切相关。本研究调查了GDF9多态性与产羔数之间的关联，并研究了 miR-6388 对绵羊 GCs 中GDF9的转录后调控作用。变异最初通过对 20 只母羊进行桑格测序鉴定，随后在 377 只 3 岁母羊中进行基因分型，包括 231 只苏尼特（SN）羊和 146 只乌珠穆沁（UM）羊以进行关联分析。预测了靶向GDF9 3′UTR 中与产羔数相关变异的候选 miRNAs，并使用双荧光素酶报告基因检测评估了 miR-6388-GDF9相互作用。RT-qPCR、蛋白质印迹法、EdU 掺入和流式细胞术用于评估内源性GDF9表达和 GC 功能。鉴定出 12 个单核苷酸多态性，包括推测为新的变异 g.42114076C>G。由GDF9的多态性 g.42116936C>T、g.42113821T>A 和 g.42113962G>A 组成的连锁不平衡块在 SN 和 UM 羊中均与产羔数显著相关，而 c.477G>A 仅在 UM 羊中与产羔数相关。报告基因检测显示，携带 g.42113962G>A 中 G 等位基因的GDF9 3′UTR 区域比对携带 A 等位基因的区域更敏感于 miR-6388 介导的抑制作用。miR-6388 过表达降低了GDF9 mRNA 和 GDF9 蛋白水平，抑制 GC 增殖，改变细胞周期分布，并促进细胞凋亡，而 miR-6388 敲低增加了GDF9表达和 GC 增殖并减少了细胞凋亡。这些细胞变化伴随着细胞周期和细胞凋亡相关基因以及 TGF-β信号相关成分的表达改变。
引言
产羔数是绵羊最重要的经济性状之一，也是繁殖性能的关键指标。然而，许多绵羊品种的多产性仍然相对较低，低多产性品种通常在每次产羔时只产单羔 [1]。因此，有限的繁殖力被视为制约绵羊生产效率和农场盈利能力的重要因素 [2], [3], [4]。传统育种策略长期以来被用于改善繁殖性状；然而，由于这些性状通常表现出低遗传力和复杂的遗传架构，遗传进展仍然缓慢。因此，仅靠传统选择快速改善繁殖性能仍然具有挑战性。在这种情况下，将标记辅助选择与候选基因的功能研究相结合，可能为改善绵羊繁殖性状提供一种更精确和有效的策略。
在与排卵率和产羔数相关的基因中，生长分化因子 9（GDF9）在调节母羊生育力方面发挥关键作用 [5]。GDF9中的多个编码和调控变异已与小尾寒羊、鲁中肉羊、蒙古羊等其他品种的多产性相关 [6], [7], [8], [9]，这支持了GDF9在繁殖性能品种特异性变异中的参与。然而，大多数可用证据来源于基因型 - 表型关联研究，而非编码GDF9变异的功能后果和分子机制仍然知之甚少。
在绵羊和牛中，GDF9主要在卵泡发育过程中的卵母细胞中表达 [10]。同样，在小鼠和人类中，GDF9作为卵母细胞衍生因子参与卵泡生长 [11]。对小鼠、猪和人类卵泡的免疫组化研究检测到GDF9免疫反应性主要存在于卵母细胞中 [12]。在 3 至 6 月龄羔羊的卵巢皮质组织中，含有GDF9的顺序培养系统促进了原始卵泡的激活和随后的体外卵泡发育 [13]。在绵羊中，卵母细胞衍生因子GDF9和 BMP15 作用于相邻的颗粒细胞（GCs）以刺激 DNA 合成和增殖，从而促进卵泡生长 [14]。此外，年轻羔羊中GDF9 mRNA 丰度显著高于 6 或 12 月龄动物，表明GDF9在早期卵泡发育中可能具有潜在作用 [15]。作为转化生长因子-β（TGF-β）超家族的一员，GDF9通过受体介导的 SMAD 信号调节颗粒细胞功能。在大鼠 GCs 中，GDF9激活 SMAD2 信号 [16] 并通过 I 型受体 ALK5/TGFBR1 传递信号 [17]。纯化的重组人 GDF9 在 KGN 细胞中激活 SMAD3 信号并刺激原代大鼠 GCs 的 DNA 合成 [18]。ACVR1B，也称为 ALK4，是参与 GCs 中 activin 诱导的 SMAD2/3 信号的 I 型受体 [19], [20]。在人类颗粒 - 黄体细胞中，外源性 GDF9 增加了ACVR1B、SMAD2和SMAD3的 mRNA 丰度，并增强了 activin A 诱导的 SMAD2/3 磷酸化 [21]。内源性 GDF9 也被认为参与调节这些细胞中 activin A 诱导的抑制素 B 的产生 [22]。综上所述，这些发现表明GDF9在功能上与 TGF-β超家族中的 SMAD2/3 介导的信号传导相关联，并支持 ACVR1B、SMAD2 和 SMAD3 作为参与 GC 调控的 GDF9 响应信号网络组件。
微小 RNA（miRNAs）是小的非编码 RNA，长度约为 22 个核苷酸，它们在转录后水平调节基因表达 [23]。成熟 miRNAs 通常结合到靶 mRNAs 的部分互补位点，通常位于 3'非翻译区（3′UTRs）内，从而抑制翻译或促进 mRNA 降解 [24]。近期综述的证据表明，miRNAs 存在于卵巢细胞中，包括卵母细胞和 GCs，以及细胞外囊泡中，并被认为与卵泡发育以及 GC 增殖和凋亡的调节有关 [25], [26]。例如，miR-145 通过直接靶向ACVR1B抑制小鼠 GC 增殖 [27]，而 miR-378 下调猪 GCs 中的芳香化酶蛋白表达和雌二醇产生 [28]。综上所述，这些发现表明 miRNAs 是 GC 功能和卵泡发育的重要转录后调节因子。
苏尼特（SN）羊主要分布在内蒙古西部，而乌珠穆沁（UM）羊主要分布在内蒙古东部。这两个品种均属于蒙古羊群体，并很好地适应了粗放放牧系统和寒冷、干旱的环境 [29]。在本研究中，我们整合了群体遗传分析、miRNA 功能检测和信号分析，以调查GDF9 3′UTR 中的候选功能变异如何可能贡献于绵羊繁殖性状的变异。通过将这种变异与 miR-6388 介导的转录后调控联系起来，并表征与GDF9表达变化及 TGF-β超家族信号组件相关的变化，本研究为与本土绵羊品种卵泡发育和产羔数相关的潜在多层调控机制提供了见解。
章节片段
伦理标准
所有动物程序均符合中国科技部《实验动物管理条例》（2004 年）。实验方案于 2015 年 5 月 15 日获得内蒙古大学机构动物护理和使用伦理委员会的批准（批准号 IMU-2015-03）。
样本和数据
总共从苏尼特羊繁育科技有限公司和呼和牧业发展有限公司征集了 377 只健康的 3 岁母羊（231 只 SN 和 146 只 UM），
GDF9 变异的鉴定
为了鉴定GDF9内的遗传变异，我们使用桑格测序对十只 SN 羊和十只 UM 羊品种进行了测序，鉴定出十一个已知突变和一个新突变。其中，g.42116722T>G (rs420975017)、g.42116936C>T (rs428242918)、g.42116953C>T (rs591690695)、g.42117384C>T (rs401365297) 和 g.42117426T>C (rs348751428) 位于启动子区域。突变 c.471C>T (rs422644056) 和 c.477G>A (rs160076413) 位于外显子 1，
讨论
GDF9不仅是绵羊中公认的繁殖力基因，也是卵泡发育的剂量敏感调节因子。自然发生的GDF9突变可以增加杂合子母羊的排卵率和产羔数，而相同的突变在纯合子状态下可能会破坏卵泡发育并导致不育 [5], [33]。尽管如此，在一些绵羊品种中也有例外报告 [34]。在细胞水平上，外源性 GDF9 已被证明可以促进 GC 增殖和
结论
本研究通过联系GDF9多态性、miR-6388 介导的调控以及颗粒细胞增殖和凋亡的变化，为绵羊繁殖力的遗传和转录后调控提供了新的见解。研究结果表明，特定的GDF9变异与 SN 和 UM 羊的产羔数显著相关。此外，miR-6388 靶向GDF9 3′UTR 中包含 g.42113962G>A 的区域，调节 GDF9 表达，并与 GC 变化相关
CRediT 作者贡献声明
甘茁尔: 数据整理。那仁扎那: 数据整理。安新月: 验证，数据整理。阿拉坦苏赫: 验证，数据整理。仓明: 调查。同斌: 写作 - 审查与编辑，监督，调查，数据整理，概念化。布贺: 监督，调查。曹桂芳: 监督，调查。徐建宇: 写作 - 原稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理。白艳宇: 写作 - 原稿，
致谢
本研究得到了重大科技项目（编号：2021ZD0024）、技术创新重大示范项目（编号：2025ZDSF0023）、锡林郭勒科技计划（编号：GD202210）、草地家畜繁殖调控与育种国家重点实验室（编号：2021ZZ0204、2025KYPT0081 和 2026CXPT02003）以及中央引导地方科学技术发展资金中国内蒙古项目（编号：2025ZY0051）的资助。
徐建宇|白艳宇|安新月|阿拉坦苏赫|甘茁尔|那仁扎那|布贺|曹桂芳|仓明|同斌
草地家畜繁殖调控与育种国家重点实验室，内蒙古大学生命科学学院，中国呼和浩特 010020
