《Ultrasonics Sonochemistry》：Ultrasound-assisted extraction of
Allium macrostemon Bunge polysaccharides: optimization of extraction process, structural characterization and immunomodulatory effects
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传统中药薤白（Allium macrostemon Bunge, AMB）兼具食用营养价值和健康益处。尽管其被广泛应用于多个领域，但目前对其多糖组分的研究仍有限。本研究采用超声辅助提取制备薤白多糖（AMBP），并分别应用Box-Behnken设计（BBD）、遗
传统中药薤白（Allium macrostemon Bunge, AMB）兼具食用营养价值和健康益处。尽管其被广泛应用于多个领域，但目前对其多糖组分的研究仍有限。本研究采用超声辅助提取制备薤白多糖（AMBP），并分别应用Box-Behnken设计（BBD）、遗传算法优化反向传播神经网络（GA-BP）和梯度提升决策树（GBDT）三种策略优化提取参数。实验结果表明，与BBD和GBDT模型相比，GA-BP模型表现出更优的数据拟合和预测性能，预测精度显著更高。决定系数（R2）达到0.9829，均方根误差（RMSE）为0.3086，平均绝对误差（MAE）为0.1717。GA-BP模型预测的最佳条件为：温度50?°C，提取时间33?min，液料比1:30?g/mL。通过柱层析分离纯化得到中性多糖AMBP-1，并随后进行结构表征。结果表明，AMBP-1是一种均一多糖，相对分子质量为5.56?kDa，呈现不规则片状形貌，其主链结构为→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Galp-(1→。初步的体外细胞实验和体内免疫抑制小鼠模型表明，AMBP-1具有免疫调节活性，多组学分析揭示了其作用与肠道菌群、血清代谢物和免疫相关转录谱变化之间的潜在关联。总之，本研究建立了由GA-BP模型优化的高效超声辅助提取工艺，为AMBP的制备提供了可靠的技术基础，并为AMBP-1在功能性食品和营养保健品中的应用奠定了基础。
**研究背景与问题**
薤白（*Allium macrostemon* Bunge）是药食同源的传统中药，其多糖（AMBP）具有抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗炎及保肝等多种活性，但相关研究仍有限。目前多糖提取工艺优化常采用响应面法中的Box-Behnken设计（BBD），该方法虽可初步优化参数，但难以准确拟合多因素间的非线性关系，预测稳定性和精度不足。机器学习方法如遗传算法优化反向传播神经网络（GA-BP）和梯度提升决策树（GBDT）在复杂非线性问题分析中具有独特优势，然而在AMBP提取优化中的应用尚未见报道。此外，AMBP的免疫调节活性及机制研究尚属空白。因此，本研究旨在比较BBD、GA-BP和GBDT三种模型在超声辅助提取AMBP工艺优化中的性能，并进一步探究AMBP-1的免疫调节作用及潜在机制。
**主要技术方法**
研究人员采用超声辅助提取（UAE）制备AMBP，并利用Lasso回归筛选关键因素，随后分别应用BBD、GA-BP神经网络和GBDT三种模型优化提取参数（温度、时间、液料比）。通过DEAE-52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶渗透层析纯化得到中性多糖AMBP-1。结构表征采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量、PMP柱前衍生-HPLC分析单糖组成、扫描电子显微镜（SEM）观察形貌、核磁共振（NMR）波谱（1H、13C、HSQC、HMBC、NOESY、COSY）及甲基化-气相色谱质谱联用（GC-MS）分析糖苷键类型。体外免疫活性采用RAW264.7巨噬细胞模型检测NO、TNF-α和IL-6分泌。体内免疫活性采用环磷酰胺（CTX）诱导的C57BL/6小鼠免疫抑制模型（来源于浙江中医药大学实验动物中心），评估体重、免疫器官指数、血清细胞因子（TNF-α、IL-6）和免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）水平，并进行H&E染色。多组学分析包括16S rRNA基因测序分析肠道菌群、LC-MS血清代谢组学及脾脏转录组学（RNA-seq）。
**研究结果**
- **Lasso回归结果**：通过Lasso回归筛选出提取时间、温度和液料比为三个关键因素，超声功率影响最小，可固定为较低水平以节省能耗。
- **BBD实验结果**：基于BBD的三因素三水平实验，响应面模型显著（p<0.01），失拟项不显著，R2=0.9384，各因素影响顺序为提取时间>温度>液料比，最优条件为49.546℃、1:32.010 g/mL、37.241 min，预测提取率为26.052%。
- **GA-BP神经网络结果**：GA-BP模型通过遗传算法优化初始权重和阈值，拟合优度R2=0.9829，MAE=0.1717，RMSE=0.3086，预测最优条件为50℃、33 min、1:30 g/mL，实际提取率为28.83%，优于BBD。
- **GBDT结果**：GBDT模型在小样本数据下拟合能力有限，整体相关系数R=0.47082，预测偏差较大，性能最差。
- **模型比较结果**：GA-BP在R2、MAE和RMSE三方面均显著优于BBD和GBDT，表明其预测精度和泛化能力最佳。
- **AMBP-1结构表征**：AMBP-1为均一多糖，分子量5.56 kDa，单糖组成为半乳糖与葡萄糖（摩尔比1:2.43）；FTIR显示多糖特征吸收峰；SEM呈不规则片状，表面有皱褶；NMR和甲基化分析确定主链为→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Galp-(1→]n，均为β-构型。
- **体外免疫调节活性**：AMBP-1在25–200 μg/mL浓度范围内对RAW264.7细胞无毒性，并能剂量依赖性地促进NO、TNF-α和IL-6的分泌，表明其可激活巨噬细胞。
- **体内免疫调节活性**：CTX诱导的免疫抑制小鼠模型中，AMBP-1（100和400 mg/kg）显著恢复体重下降，提高胸腺指数，降低因CTX引起的脾脏代偿性增大；H&E染色显示AMBP-1改善脾脏和胸腺的病理损伤。
- **血清免疫指标**：高剂量AMBP-1显著提升血清TNF-α、IL-6、IgA、IgG和IgM水平，低剂量对IL-6有提升作用，但对TNF-α无显著影响。
- **血清代谢组学**：AMBP-1干预后显著改变免疫抑制小鼠的血清代谢谱，主要富集于GABA能突触、维生素消化吸收和丁酸代谢等通路，提示其可能通过调节肠道短链脂肪酸代谢和神经递质稳态修复肠-免疫轴。
- **肠道菌群分析**：AMBP-1逆转了CTX导致的α多样性降低和β多样性偏移，恢复了Firmicutes/Bacteroidota比值，降低促炎菌Campylobacterota丰度，增加有益菌Muribaculaceae和Rikenellaceae_RC9_gut_group，减少有害菌Desulfovibrio。
- **相关性分析**：O2PLS和Spearman分析显示，关键菌属（如Alistipes、Acutalibacter）与血清差异代谢物（如吲哚-3-丙酮酸、α-酮戊二酸）显著相关，表明AMBP-1通过调节肠道菌群及其代谢物发挥免疫调节作用。
- **脾脏转录组学**：AMBP-1处理组与模型组相比，共鉴定出1001个差异表达基因，KEGG富集显示B细胞受体信号通路、Th1/Th2分化通路和JAK-STAT信号通路显著富集；免疫浸润分析表明AMBP-1显著增加活化B细胞、CD4/CD8 T细胞、Th1/Th2细胞等免疫细胞浸润，增强体液和细胞免疫。
**总结与讨论**
本研究首次系统比较了BBD、GA-BP和GBDT在超声辅助提取AMBP优化中的表现，证实GA-BP模型具有最佳预测精度和泛化能力，为中药多糖提取的智能优化提供了新思路。纯化的AMBP-1是具有β-构型主链的均一多糖，首次发现其免疫调节活性。体外实验证实其激活巨噬细胞，体内实验证实其通过恢复免疫器官指数、细胞因子和免疫球蛋白水平，改善CTX诱导的免疫抑制。多组学关联分析揭示了AMBP-1通过重塑肠道菌群、调节血清代谢物及调控B细胞和T细胞相关信号通路（如BCR、Th1/Th2分化、JAK-STAT）来增强免疫功能的潜在机制。这些发现为AMBP-1在功能性食品和免疫调节剂中的应用提供了理论依据，但具体机制仍需进一步研究。
**结论**
本研究比较了Box-Behnken设计（BBD）、GA-BP神经网络和GBDT三种模型在优化超声辅助提取薤白多糖中的性能。GA-BP模型在拟合过程中固有的复杂非线性关系方面表现出显著优势，具有优于其他两种方法的预测精度和泛化能力。超声辅助提取与机器学习的成功结合产生了可靠的最优工艺参数，提高了提取效率，并为其他中药多糖的制备提供了一种高效、绿色的技术途径。随后，研究人员纯化并表征了一种均一中性多糖AMBP-1。此前AMBP的药理学研究主要集中于心血管保护作用，而本研究确定了其免疫调节特性。体外实验表明，它能促进RAW264.7细胞中免疫因子的分泌；体内实验证实，它能恢复免疫抑制小鼠的体重、器官指数以及免疫球蛋白/细胞因子水平。多组学分析进一步揭示了AMBP-1处理与肠道菌群重塑、血清代谢物及免疫通路转录重编程之间的潜在关联。这些相关性观察为未来的机制研究提供了基础和理论依据。总之，这些发现不仅为优化AMBP的提取工艺提供了科学依据，而且将AMBP-1确立为一种具有显著应用潜力的功能性食品免疫调节剂。
