鱼肌肉粉中四种双酚类化合物新型基质标准物质的研制

《Foods》：Development of a Novel Matrix Reference Material for Four Bisphenols in Fish Muscle Powder

　　

首次研制了一种新型基质标准物质（RM），用于准确测定鱼肌肉中的双酚A（BPA）、双酚F（BPF）、双酚S（BPS）和双酚AF（BPAF）。该RM候选物通过向罗非鱼腹腔注射目标化合物，随后进行肌肉绞碎、匀浆、冷冻干燥、研磨和分装而制备。使用优化的同位素稀释-液相色谱串联质谱法（ID-LC-MS/MS）进行了均匀性、稳定性和表征研究。方差分析表明RM具有足够的均匀性。基于线性回归分析的短期和长期稳定性评估显示，在60°C储存10天或-20°C储存12个月时，未观察到显著的时间依赖性漂移。通过涉及8个实验室的实验室间研究，RM的指定指示值分别为：BPA 8.71 μg/kg，BPF 7.36 μg/kg，BPS 10.10 μg/kg，BPAF 5.43 μg/kg，相应的扩展不确定度（k = 2）分别为0.71、0.56、0.80和0.42 μg/kg。

**论文解读：鱼肌肉粉中四种双酚类化合物新型基质标准物质的研制**

**研究背景与研究问题**

双酚A（BPA）是聚碳酸酯和环氧树脂工业合成的重要有机中间体，广泛用于塑料、涂料、粘合剂等化学品以及食品包装材料、食品罐内衬和纸制品等日用品的生产。BPA的大量使用导致人类通过口服摄入、吸入和皮肤接触等多种途径广泛暴露于该化合物。对于普通人群，膳食摄入被认为是BPA暴露的主要来源。实验和流行病学研究表明，低水平BPA暴露与癌症、不孕症、糖尿病和肥胖等多种不良健康效应相关。鉴于其潜在健康风险，许多国家和地区已限制BPA的使用。欧洲食品安全局自2006年起对BPA进行了广泛风险评估，并于2023年将BPA的每日耐受摄入量（TDI）设定为0.2 ng/kg bw/day，比2015年的TDI低两万倍。

由于这些限制，BPA在工业应用中的使用逐渐被其结构类似物所取代，如双酚F（BPF）、双酚S（BPS）和双酚AF（BPAF）。然而，这些类似物并不比BPA更安全。体外和体内研究已证实，BPF、BPS和BPAF可发挥与BPA相似的内分泌干扰效应、细胞毒性、神经毒性和生殖毒性。流行病学研究表明，低水平暴露于这些BPA类似物可能导致胎儿生长受限、神经功能障碍和代谢紊乱。此外，这些类似物也广泛存在于多种食品中，其中水产品中的浓度相对较高。因此，与BPA类似，膳食摄入也被认为是人类暴露于这些类似物的主要途径。然而，与对BPA的广泛研究相比，关于BPF、BPS和BPAF的发生和毒性的研究仍然有限，其潜在健康风险尚未完全明确。

准确可靠的分析方法是食品污染物浓度监测、风险评估甚至控制措施制定的基础。以往研究使用了多种检测技术测定食品基质中BPA及其类似物的水平，并建立了多种样品前处理程序。然而，由于只有加标样品而非基质标准物质（RM）被用于方法验证和质量控制，不同实验室通过这些多样方法产生的测量结果的可靠性和可比性难以保证。基质RM是具有良好均匀性和稳定性的高阶计量材料，具有与真实样品相同的基质组成，并具有准确可靠的特征值，附有不确定度和溯源性。此类材料是实验室方法验证、能力验证和相互认可中不可或缺的测量工具，已广泛应用于食品分析以提高测量结果的准确性。然而，尽管双酚类似物的广泛污染备受关注，用于测定食品中这些化合物的基质RM仍然非常有限。因此，本研究的目的是开发一种用于鱼肌肉中BPA、BPF、BPS和BPAF的基质RM，因为水产品已被发现是人类双酚暴露的潜在重要贡献者。

**关键技术方法**

研究人员采用体内暴露实验制备原料样品：通过腹腔注射向罗非鱼施用目标双酚类化合物（BPA、BPF、BPS、BPAF），经12小时暴露后获取阳性肌肉。随后将阳性肌肉与空白肌肉按1:9质量比混合，经匀浆、冷冻干燥、研磨、过筛（40目）、三维混合（5小时）后分装至棕色玻璃瓶（每瓶5g），共制备600瓶，在-20°C储存。使用同位素稀释-液相色谱串联质谱法（ID-LC-MS/MS）进行均匀性、稳定性和定值研究。均匀性评估采用单因素方差分析（ANOVA），稳定性通过线性回归分析（短期60°C 10天，长期-20°C 12个月），定值通过8个实验室的协作研究，使用Dixon、Grubbs、Cochran和D'Agostino检验进行统计，最终确定指示值及其不确定度。

**研究结果**

**3.1 原料获取方法的选择**

研究人员比较了从超市和河流采集的鱼中双酚浓度，发现个体间变异大，难以通过现场筛选收集足够数量的阳性标本。因此选择体内暴露实验。比较了三种暴露途径（药浴、口服喂养、腹腔注射），最终选择腹腔注射，因其操作可行、成本效益高、环境友好，并能精确控制个体剂量。

**3.2 标准物质候选物制备条件的优化**

通过预实验确定注射剂量和暴露时间。当BPA、BPF、BPS、BPAF注射剂量分别为100、1500、100、25 μg/kg时，12小时后鱼肌肉粉中四种目标分析物的平均浓度更为均衡（33.8–90.7 μg/kg）。因此选择此剂量和12小时暴露时间。暴露后鱼肌肉样品中目标分析物浓度分别为BPA 15.1 μg/kg、BPF 14.3 μg/kg、BPS 18.0 μg/kg、BPAF 10.2 μg/kg；未暴露样品中分别为0.37、
**3.3 样品前处理方法的优化与验证**

比较了多种提取溶剂，最终采用水复溶后乙腈萃取，并使用石墨化碳黑（GCB）固相萃取柱净化。基质效应（ME）评估显示所有分析物的ME均小于21%，同位素内标校正后ME均小于4%。加标回收实验显示平均回收率为95.3–106.3%，相对标准偏差（RSD）<7.0%。校准曲线线性良好（R²>0.9986），检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为BPA和BPF 0.15和0.50 μg/kg，BPS和BPAF 0.015和0.050 μg/kg。采取严格质量控制措施防止背景污染。

**3.4 标准物质候选物的均匀性评估**

对16个随机选择的单元进行三重复测量，经ANOVA分析，所有四种分析物的F值均小于临界F值（1.992，α=0.05），表明在95%置信水平下RM具有足够的均匀性。均匀性不确定度（u_bb,rel）范围为0.99%–1.24%。

**3.5 标准物质候选物的稳定性研究**

短期稳定性（60°C 10天）和长期稳定性（-20°C 12个月）的线性回归分析显示，所有分析物的β₁/S_β1值均小于t_(0.95,n-2)，表明斜率无统计学显著性，即四种双酚类似物在60°C可稳定储存10天，在-20°C可稳定储存12个月。

**3.6 标准物质候选物的定值**

8个实验室参与协作定值，每个实验室每单位测量4次，共8个数据点。经Dixon、Grubbs、Cochran和D'Agostino检验，无异常值，数据服从正态分布。最终指示值：BPA 8.71 μg/kg，BPF 7.36 μg/kg，BPS 10.10 μg/kg，BPAF 5.43 μg/kg。A类不确定度（u_A）来自实验室间变异，B类不确定度（u_B）来自样品测量过程（包括溶液制备、称量等）。

**3.7 不确定度评估**

总不确定度由表征（u_A和u_B）、均匀性（u_bb）和稳定性（u_sts和u_lts）合成。相对扩展不确定度（k=2）为：BPA 0.71 μg/kg，BPF 0.56 μg/kg，BPS 0.80 μg/kg，BPAF 0.42 μg/kg。表征相关样品测量过程和稳定性是主要贡献，均匀性贡献较小。

**3.8 优势与局限性**

该研究首次报道了鱼肌肉中双酚类似物的基质RM，填补了食品安全领域肉类基质双酚RM的空白。其浓度水平（换算成湿重约1.09–2.02 μg/kg）与文献中鱼产品实际检测水平相当，具有实际应用价值。局限性包括：仅基于罗非鱼肌肉基质，需评估与其他基质的互换性；长期稳定性数据（25°C和4°C）尚缺；仅包含四种双酚类似物，需扩展；浓度范围可能不适合超痕量检测；定值仅依赖于单一分析平台（ID-LC-MS/MS），可能存在系统偏差。

**讨论与结论**

讨论部分总结了研究的优势与局限性，指出该RM填补了鱼肌肉基质中双酚类似物RM的空白，并具有实际应用价值。同时指出未来需要进一步研究的方向。

研究结论部分：本研究首次报道了用于测定鱼肌肉中四种双酚的基质RM的开发。通过腹腔注射罗非鱼，经绞碎、匀浆、冷冻干燥、粉碎、研磨、三维混合和分装，制备了约3 kg候选鱼肌肉粉。使用具有良好准确度和精度的ID-LC-MS/MS方法进行了均匀性评估和稳定性监测。该RM表现出满意的均匀性，可在60°C稳定储存至少10天或在-20°C稳定储存12个月，支持其预期用途的可靠性。根据ISO 33405:2024的要求进行了双酚指示值的赋值和不确定度评估。最终RM的指定指示值和扩展不确定度分别为5.43–10.10 μg/kg和0.42–0.80 μg/kg（k=2）。该新开发的RM将成为鱼肌肉中双酚准确检测的分析方法验证和实验室质量控制的有价值工具。其应用将有助于建立和维持鱼源食品中可靠的监测结果。此外，通过实现鱼中双酚的准确定量，该RM还可为膳食暴露计算提供技术支持，从而增强本研究在双酚风险评估中的实际价值。该论文发表在《Foods》上。