一株天然存在的具有高八氢番茄红素积累的泡囊短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）菌株的分离与鉴定

《Foods》：Isolation and Characterization of a Naturally Occurring Brevundimonas vesicularis Strain Exhibiting High Phytoene Accumulation

　　

八氢番茄红素（Phytoene），一种无色的类胡萝卜素前体，因其良好的生物利用度、抗氧化活性以及在功能性食品、营养保健品和动物营养中的潜在应用而日益受到关注。然而，其工业利用仍受到低自然丰度以及当前生产策略依赖基因工程或代谢途径操纵的限制。在本研究中，研究人员鉴定并表征了一株天然存在的泡囊短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）菌株（Bv-xms2024），该菌株无需基因修饰即可表现出显著的八氢番茄红素积累。通过形态学、生化、分子、基因组、代谢组和转录组分析对该菌株进行了全面表征。定量LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）分析表明，Bv-xms2024在培养96 h后，八氢番茄红素积累量达到420.42 ± 98.11 μg/g干生物量，显著超过下游类胡萝卜素（包括β-胡萝卜素和虾青素）的水平。培养参数优化确定25 °C、pH 7.0和96 h为八氢番茄红素积累的最佳条件，而连续传代证实了其在20代内的稳定生产。基因组注释鉴定了类胡萝卜素生物合成基因库，而RT-qPCR（逆转录定量PCR）分析揭示了从早期crtE和crtB上调到后期下游途径基因上调的时间变化，与观察到的八氢番茄红素主导的类胡萝卜素谱一致。在小鼠和鸡中的短期耐受性评估显示，在测试条件下未观察到明显的不良影响。总之，这些发现将Bv-xms2024确定为一种有前景的八氢番茄红素生产的天然微生物资源，并为进一步的工艺开发和菌株水平安全性评估提供了基础。

八氢番茄红素（phytoene，类胡萝卜素合成途径中的第一个无色中间体）因其高生物利用度、抗氧化活性及在功能食品、营养保健品和动物营养中的潜力而备受关注，但其自然丰度低，当前生产依赖基因工程，限制了工业应用。泡囊短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）属含类胡萝卜素基因簇，但天然产八氢番茄红素菌株研究不足，且部分菌株为机会致病菌，需安全评估。为此，研究人员从环境样品中分离一株天然菌株Bv-xms2024，通过形态学、生化、16S rRNA鉴定其种属；利用Oxford Nanopore平台完成全基因组测序与组装；采用LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）定量68种类胡萝卜素；通过L₉(3³)正交试验优化培养参数（时间、温度、pH）；利用RT-qPCR（逆转录定量PCR）分析6个关键类胡萝卜素生物合成基因（crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ、crtW）的时序表达；并在小鼠（40只昆明小鼠，雌雄各半，分四组）和鸡（20只42日龄SPF雏鸡和20只270日龄蛋鸡，每组10只）中进行14天口服耐受性评估。研究得出结论：Bv-xms2024在96 h培养后八氢番茄红素积累量达420.42 ± 98.11 μg/g干生物量，显著高于下游类胡萝卜素（β-胡萝卜素21.66 μg/g、虾青素9.55 μg/g等）；优化条件为25°C、pH 7.0、96 h；连续传代20代产量稳定；基因组注释了类胡萝卜素合成基因簇，crtE/crtB在48 h早期上调，crtI/crtY/crtZ/crtW在96 h后期上调，与代谢物谱一致；小鼠和鸡短期暴露未观察到不良影响。该研究为天然八氢番茄红素生产提供了新型微生物资源，论文发表在《Foods》。

**研究结果：**

**3.1 菌株形态特征**：在LB琼脂上，菌落24 h内由透明变为橙黄色，革兰氏染色呈红色，为革兰阴性短杆菌。

**3.2 生理生化特征**：柠檬酸盐利用阳性、过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、不产硫化氢、吲哚阴性、脲酶阴性、能发酵葡萄糖和蔗糖，不发酵乳糖。

**3.3 分子鉴定与系统发育分析**：16S rRNA基因序列与泡囊短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）相似性99.5%，系统发育树显示Bv-xms2024与B. vesicularis菌株聚类，确定其为B. vesicularis。

**3.4 生长曲线分析**：生长曲线分为四个阶段：延滞期（24–40 h）、指数期（40–60 h，比生长速率0.2616 h^-1，世代时间2.65 h）、稳定期（60–64 h）、衰亡期（64–72 h，半衰期4.565 h）。

**3.5 抗生素敏感性试验**：对氨苄西林、吡哌酸、诺氟沙星、磺胺嘧啶、林可霉素无抑菌圈；对多西环素抑菌圈最大（60 mm），其次为氯霉素（50 mm）、庆大霉素（45 mm）、卡那霉素和四环素（44 mm）。

**3.6 类胡萝卜素生产与代谢组谱**：LC-MS/MS定量分析68种类胡萝卜素，96 h时八氢番茄红素含量最高（420.42 ± 98.11 μg/g干生物量），远高于β-胡萝卜素（21.66 μg/g）、虾青素（9.55 μg/g）、玉米黄质（8.44 μg/g）和八氢番茄红素（5.01 μg/g），表明菌株大量保留前体八氢番茄红素。

**3.7 培养参数优化与稳定性**：L₉(3³)正交试验显示，最佳条件为L5（25°C、pH 7.0、96 h），八氢番茄红素达303.24 ± 21.78 μg/g，初始pH影响最大。连续传代至G20，G1（314.62 μg/g）、G10（329.61 μg/g）、G20（354.01 μg/g）间无显著差异（p=0.114），证明产量稳定。

**3.8 全基因组组装与注释**：长读长测序组装获得单个环状染色体3,263,986 bp，GC含量66.05%，测序深度329.34×。功能注释鉴定了类胡萝卜素生物合成基因簇，并通过CARD（抗生素耐药性数据库）、VFDB（毒力因子数据库）和PHI（病原-宿主互作数据库）筛选，发现23个抗生素耐药基因、160个毒力因子同源基因和653个表型关联基因。

**3.9 类胡萝卜素生物合成基因表达分析**：RT-qPCR显示，crtE和crtB在48 h显著上调（p<0.0001），72 h仍维持高水平；crtI、crtY、crtZ在72 h轻微上调（p<0.05），crtW无变化；96 h时crtI、crtY、crtZ、crtW均显著上调（p<0.0001），与96 h检测到下游类胡萝卜素（如虾青素）一致，表明上游基因早期激活，下游基因后期激活。

**3.10 动物安全性评估**：小鼠14天口服Bv-xms2024悬液（10⁹、10¹⁰、10¹¹ CFU/mL），各剂量组与对照组体重增长无显著差异（p>0.05），无死亡或异常行为。鸡实验中，42日龄SPF雏鸡和270日龄蛋鸡在14天自由饮用Bv-xms2024培养液后，体重增长正常，无不良反应。

**讨论与结论**：讨论部分指出，Bv-xms2024在未基因修饰条件下呈现八氢番茄红素主导的类胡萝卜素谱，产量（420 μg/g干重）虽低于部分工程菌株（如Blakeslea trispora 5.02 mg/g、Dunaliella salina 1.08 mg/g），但天然性避免了复杂工艺和调节顾虑，为后续优化提供了基线。基因表达分析显示crtE/crtB早期上调、下游基因后期上调，与代谢物积累模式一致，但未明确限速步骤。抗生素敏感性结果因缺乏种属特异性标准仅作描述性报道。动物实验初步表明短期耐受性良好，但缺乏血液学和组织病理学评估。最终结论翻译：Bv-xms2024被鉴定为一株天然存在的具有显著八氢番茄红素积累的泡囊短波单胞菌（Brevundimonas vesicularis）菌株。该菌株在培养96 h后主要积累八氢番茄红素，表现出类胡萝卜素生物合成基因的时间依赖性表达，并在所选培养条件下连续传代期间保持相当的八氢番茄红素水平。在测试条件下，小鼠和鸡的短期暴露未引起可观察到的不良影响。这些发现支持Bv-xms2024作为八氢番茄红素生产的天然微生物资源，尽管在食品和饲料相关应用中需要进一步的工艺优化、纯化验证和安全性评估。