部分去除果肉对农场可可发酵过程中微生物动态和代谢物谱的影响

《Foods》：Effects of Partial Pulp Removal on Microbial Dynamics and Metabolite Profiles During On-Farm Cocoa Fermentation

　　

部分可可果肉去除可能改变底物可用性，并影响发酵过程中的微生物动态和代谢动态。本研究评估了带果肉豆和去果肉豆对农场可可发酵过程中微生物动态和代谢物谱的影响。研究人员评估了三种处理，持续144小时：CT（100%带果肉豆）、TA（75%带果肉豆+25%去果肉豆）和TB（50%带果肉豆+50%去果肉豆）。在整个发酵过程中，分析了理化参数、可培养微生物种群、选定的微生物分离株、糖类和有机酸。部分果肉去除与糖类和有机酸谱的差异相关，而温度、pH和可滴定酸度（TTA）表现出可可发酵特征性的时间进程，且处理间和发酵时间间存在显著差异。在选定的酵母分离株中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）被频繁鉴定，而醋酸菌属（Acetobacter sp.）和假果糖杆菌（Fructobacillus pseudoficulneus）属于鉴定的细菌分类群。探索性主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）表明，发酵时间是样品分化的主要因素，而部分果肉去除与理化和微生物谱的次要关联相关。总体而言，部分果肉去除与微生物和代谢物谱的差异相关，表明其作为调节可可发酵策略的进一步研究潜力。

**研究背景、问题与意义**
可可（Theobroma cacao L.）是巴西等热带地区的重要经济作物，其种子经发酵后用于巧克力生产。传统发酵依赖果肉中的糖类作为微生物底物，但果肉也是可回收的副产物（如冻果肉、果酱）。然而，果肉去除程度如何影响发酵环境中的微生物动态和代谢物谱尚未充分阐明。现有研究多关注微生物演替或发酵质量，而较少探讨不同果肉去除水平如何在农场实际条件下改变底物可用性，进而影响微生物动态和代谢产物。因此，本研究旨在评估部分去除果肉对巴西亚马逊地区可可发酵过程中可培养微生物种群、选定分类群、糖类动态、有机酸谱及理化变化的影响，以探索其作为调控发酵策略的潜力。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员在巴西帕拉州Moju市Dois Irm?os农场进行了一次现场可可发酵（Forastero群），设置三种处理：CT（100%带果肉豆）、TA（75%带果肉豆+25%去果肉豆）、TB（50%带果肉豆+50%去果肉豆），每个处理三个独立发酵箱，发酵144小时，遵循生产者常规翻堆操作（48小时后每24小时翻一次）。通过培养计数、分子鉴定（16S rRNA和ITS测序）、高效液相色谱（HPLC）分析糖和有机酸，并结合线性混合效应模型、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）进行统计。结论：部分果肉去除改变了糖和有机酸谱，但发酵进程整体保持；发酵时间是样品分化的主要因素，而部分果肉去除是次要因素；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是最频繁鉴定的酵母，醋酸菌属（Acetobacter sp.）和假果糖杆菌（Fructobacillus pseudoficulneus）是主要细菌类群。该研究提示部分果肉去除可作为调控可可发酵的潜在策略，论文发表在《Foods》。

**主要关键的技术方法**
- **现场发酵实验**：在巴西帕拉州Moju市Dois Irm?os农场（纬度02°02′07.554″ S，经度48°42′28.536″ W），使用Forastero群可可果，手动去果肉（Metvisa水果去核机）后，将种子装入木箱进行自发发酵，三处理三重复，144小时，翻堆操作标准化。
- **理化分析**：测定pH（AOAC 970.21）、总可滴定酸度（TTA，AOAC 31.06.06）和温度（数字温度湿度计Instrutherm HT-600）。
- **微生物培养与鉴定**：样品采集后，对酵母（YPD琼脂）、乳酸菌（LAB，MRS琼脂加制霉菌素）和醋酸菌（AAB，GYEC琼脂加制霉菌素）进行平板计数，随机选取菌落纯化，通过16S rRNA（引物8F/1492R）和ITS1-5.8S-ITS2（引物ITS1/ITS4）测序进行分子鉴定，使用最大简约法（MP）构建系统发育树。
- **代谢物分析**：采用高效液相色谱（HPLC，Aminex HPX-87H柱，折射率检测器）定量葡萄糖、果糖、蔗糖及柠檬酸、乳酸、乙酸。
- **统计分析**：线性混合效应模型（固定效应：处理、时间及交互；随机效应：发酵箱），Holm-Bonferroni校正；PCA和HCA（z-score标准化，欧氏距离，Ward连接）。

**研究结果**
**3.1 理化参数**
通过测定pH、总可滴定酸度（TTA）和温度，发现所有处理中TTA随发酵时间增加，pH降低，温度升高，符合典型可可发酵进程。处理间存在显著差异（p<0.05），且与时间交互显著。部分果肉去除影响了底物可用性，但未抑制发酵整体进程；温度反映出活跃微生物代谢，而TTA对果肉去除水平更敏感。

**3.2 酵母和细菌的鉴定**
通过培养计数和分子鉴定，酵母菌群中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是最频繁分离的物种，其次为汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）和毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。细菌中，醋酸菌属（Acetobacter sp.，包括接近A. oryzoeni、A. tropicalis和A. oryzifermentans的菌株）和乳酸菌中的假果糖杆菌（Fructobacillus pseudoficulneus）及远藤乳杆菌（Lentilactobacillus farraginis）被鉴定。部分果肉处理（TA和TB）中酵母计数较低，但AAB在48小时后因翻堆供氧而增加。系统发育树（最大简约法）确认了各分类群的归属。

**3.3 有机酸和糖类的HPLC分析**
通过高效液相色谱（HPLC）定量，初始柠檬酸浓度在CT中最高（0.56 mg/g），TA和TB较低，与果肉去除直接相关。发酵后期，柠檬酸在TA和TB中升高，可能因微生物利用减少。乳酸和乙酸浓度变化与微生物谱一致；TB在144小时乙酸浓度最高（3.30 mg/g），显著高于其他处理（p<0.05），但需注意提取方法对回收率的影响。葡萄糖和果糖浓度在CT中持续下降，TA和TB中相对稳定；蔗糖变化不大（1.21–1.40 mg/g）。部分果肉去除降低了初始糖浓度，但发酵仍进行。

**3.4 多变量分析（PCA和HCA）**
主成分分析（PCA）显示前三个主成分解释81.18%方差：PC1（46.19%）与pH、酵母、LAB、乳酸正相关，与TTA、乙酸、蔗糖、柠檬酸、AAB负相关，反映酸化进程；PC2（21.68%）主要受果糖、葡萄糖、柠檬酸、蔗糖影响，代表底物可用性；PC3（13.31%）与AAB和LAB相关，代表菌群变化。得分图显示样本按发酵时间分化，早期样本与高pH和糖相关，后期与酸度和细菌活性相关。层次聚类分析（HCA）将样本分为早期/中期和晚期两大簇，发酵时间是主要分组因素，部分果肉处理在晚期形成亚簇，表明次要影响。

**总结讨论与结论翻译**
讨论部分指出：部分果肉去除改变了底物可用性，导致糖和有机酸谱差异，但微生物活动仍维持；酿酒酵母和醋酸菌属的频繁出现表明核心功能群未受抑制；由于本研究仅基于培养依赖方法，且只进行了一次发酵周期，结果需在更多季节和系统中验证。结论翻译如下：部分果肉去除改变了可可发酵过程中的糖可用性、有机酸动态和可培养微生物群落的丰度。底物可用性降低改变了发酵环境，产生了不同的微生物和代谢物谱，同时保持了发酵过程的整体进程。探索性PCA和HCA表明，发酵时间是样品分化的主要因素，而部分果肉去除对理化和微生物谱产生了次要变异。这些发现表明，部分果肉去除是一种有前景的可可发酵技术策略。然而，本研究结果仅限于该次发酵周期，需进一步研究不同收获季节、生产年份和系统以评估其广泛适用性。本研究的另一个局限性是微生物表征仅基于培养依赖方法及选定分离株的鉴定，因此仅描述了可培养部分，未涵盖不可培养或低丰度微生物。未来研究应结合感官评价、培养独立技术（如扩增子测序或宏基因组分析），以更全面地理解微生物群落的时间动态，以及部分果肉去除如何影响可可发酵的整体微生物生态。