组织中三维基因组结构与基因表达的整合空间分析

《Cell》：Integrative spatial profiling of 3D genome organization and gene expression in tissue

　　

三维基因组组织（3D genome organization）塑造了转录调控，但在完整组织内原位测量其空间协调性仍具挑战。研究人员提出了空间Hi-C-RNA（Spatial Hi-C-RNA），一种多模态平台，能够从同一组织切片以近单细胞分辨率同时绘制全基因组染色质接触和转录组图谱。在小鼠脑、发育胚胎和人黑素瘤（human melanoma）中，Spatial Hi-C-RNA生成了与组织解剖结构一致的多模态图谱，同时揭示了互补的染色质和RNA定义的空间模式。多尺度特征，包括A/B区室（A/B compartments）、拓扑关联结构域（topologically associating domains，TADs）和染色质环（chromatin loops），与区域和细胞类型特异性转录程序相关联。在小鼠胚胎中，Spatial Hi-C-RNA解析了发育阶段神经元成熟过程中的协调染色质和转录重塑。在人黑素瘤中，染色质结构描绘了仅凭RNA无法检测到的瘤内亚区域，并将肿瘤状态转变与区室、结构域边界和调控程序的变化联系起来。因此，Spatial Hi-C-RNA提供了一个广泛适用的框架，用于研究天然组织环境中发育和疾病中的基因组结构-功能关系。

**论文解读**

**研究背景与目的**
基因组的三维（3D）组织是基因调控的基础层面，空间折叠将远端调控元件拉近，协调决定细胞身份和状态的转录程序。从染色体区域、A/B区室、拓扑关联结构域（TAD）到染色质环，这种层级结构对发育和分化至关重要，其失调会导致癌症和神经发育疾病。因此，解析基因组结构如何调控基因表达，需要在天然组织环境中同时测量染色质结构和转录输出。尽管已有单细胞Hi-C（high-throughput chromatin conformation capture，高通量染色质构象捕获）技术及共分析染色质接触与RNA的方法，但这些方法需要组织解离，丢失了理解体内基因组调控所必需的空间背景。新兴的空间组学技术可原位分析DNA甲基化、染色质可及性、组蛋白修饰、转录本和蛋白质，但缺乏能同时进行全基因组染色质构象和全转录组无偏检测的可扩展技术。为此，研究人员开发了Spatial Hi-C-RNA，一种在同一组织切片上以近单细胞分辨率同时绘制3D染色质结构和全转录组图谱的空间多组学平台。该技术应用于成年小鼠脑、发育中小鼠胚胎和人黑素瘤，揭示了组织特异性的空间结构，其中染色质组织与基因表达共同定义空间区域，并展示了模态特异性模式。论文发表在《Cell》。

**关键技术方法**
Spatial Hi-C-RNA整合了确定性微流控原位条形码技术、高通量染色质构象捕获和RNA测序（RNA-seq）。首先，新鲜冷冻组织切片经双交联（甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯）固定以保持染色质结构。透化后，原位进行逆转录，使用含唯一分子标识符（UMI）和通用连接接头的生物素化poly(T)引物合成cDNA。随后，用三种限制性内切酶（DpnII、DdeI、HinfI）消化交联染色质，进行邻近连接。为减少开放染色质偏好并提高Tn5转座效率，在通过Tn5转座插入通用连接接头前用SDS处理切片。空间条形码通过依次施加两个正交方向聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片实现，经两轮连接在微通道交叉处引入独特条形码组合（A_i和B_j），定义每个组织点的空间坐标。DAPI染色用于观察组织形态。最后，通过反向交联释放条形码化的Hi-C DNA片段和生物素化cDNA，分别构建Hi-C文库和RNA文库。样本来源：成年小鼠脑（2月龄C57BL/6小鼠冠状切片）、人黑素瘤（67岁白人男性结节性黑素瘤手术标本，IIB期，Breslow厚度4 mm，Clark III级）、小鼠胚胎（E11.5和E13.5 C57BL/6小鼠）。

**研究结果**

**Spatial Hi-C-RNA联合3D基因组与基因表达分析**
该方法在成年小鼠脑中产生6,275个空间像素，每个像素中位Hi-C接触数（593,680个独特读段对）与基于液滴的单细胞Hi-C方法相当，RNA模态检测到每像素中位1,458个基因和3,210个UMI。接触概率衰减曲线在不同样本间一致，聚集接触图显示清晰的区室化和结构域结构，区室值和绝缘评分与参考数据集一致。独立重复实验显示高度一致。

**小鼠脑的整合染色质与RNA图谱**
基于Spatial Hi-C的无监督聚类可概况主要解剖结构（海马、丘脑、皮质板层），而RNA聚类显示更精细的转录差异。Hi-C将CA区归为一个聚类，RNA将其分为CA1/2和CA3。整合聚类保留了解剖一致区域并改善了生物学划分。特征重要性分析表明整合聚类由RNA和Hi-C数据共同支持。

**全基因组分析将染色质组织与协调转录程序关联**
通过对500-kb基因组bin的A/B区室评分与基因活性进行Pearson相关分析，发现基因组范围正相关占主导，表明活跃染色质环境与高转录相关。代表性位点（如chr5和chr4）在神经元富集区域显示活跃区室状态，局部和远端共表达基因富集神经元和突触功能。通过Hi-C衍生嵌入识别共表达模块，模块活性在组织上呈现空间连贯模式，对应解剖区域。

**多尺度染色质组织构成细胞类型特异性转录程序的基础**
神经元富集区域（皮质、海马CA、DG）显示比白质区域更高的短距/长距接触比。通过MERFISH参考标签转移注释细胞类型，发现神经元比非神经元有更高的顺式短/长接触比。A/B区室分析鉴定出357个可变100-kb bin，区室评分与基因表达紧密对应。TAD边界概率和染色质环在匹配细胞类型间更相似。在特定基因座，如Rorb在L4/5 IT神经元中显示环相互作用，Zic1/Zic4在MH Tac2+神经元中与VISTA增强子hs654形成环。

**空间3D基因组组织区分黑素瘤中的转录状态**
Spatial Hi-C-RNA应用于人黑素瘤，产生6,199个空间像素。Hi-C和RNA聚类显示共享和模态特异性的空间异质性，Hi-C进一步划分RNA看似均质的区域。整合聚类揭示了A/B区室切换：C1和C2富集免疫激活，C0/C3/C4/C5富集肿瘤区域，后者显示更高短/长接触比。细胞类型解卷积鉴定出黑色素细胞、神经嵴样和过渡态等肿瘤微环境，与成纤维细胞和浆母细胞共定位。代表性基因座LYZ和PAX3显示区域特异性区室状态、基因表达和染色质可及性。

**整合多模态分析揭示黑素瘤细胞状态转变中的染色质-基因耦合**
拟时序分析显示从黑色素细胞富集区域到去分化肿瘤状态的连续轨迹。A/B区室评分和基因表达沿拟时序发生渐进变化，多数基因座显示协调的区室和转录重塑。3D结构分析检测到肿瘤区域CDKN2A/CDKN2B的局灶缺失。TAD边界分析鉴定出肿瘤区域中193个丢失和187个新增边界，差异绝缘评分与基因表达变化相关。SCENIC+分析识别出免疫调控因子（RUNX1、IKZF3）和肿瘤区域调控因子（MITF、HMGA2），并聚焦ETV5相关调控网络，其下游靶基因GAB2在肿瘤区域富集。iStar整合H&E组织学特征生成超分辨率染色质图谱，预测的区室评分与实测图谱一致。

**Spatial Hi-C-RNA揭示胚胎神经发生中的3D基因组重塑**
对E11.5小鼠胚胎以10-μm分辨率分析，捕获32,799个空间像素。整合聚类对应的解剖结构与H&E染色一致，模态主导分析显示大多数聚类由RNA驱动。通过scRNA-seq参考标签转移，识别出神经祖细胞、分化神经元等。后脑拟时序分析显示从放射状胶质细胞（C8）到神经元富集区域（C10）的连续梯度。全局短/长接触比在腹侧后脑递增，区域染色体19的A区室特征随神经元成熟增强。在5-kb分辨率下，分化神经元基因Dscaml1在神经元富集区域显示增强环接触，而祖细胞标志物Racgap1在祖细胞中增强。VISTA增强子数据库验证显示Zic1/Zic4、Ntrk2、Nr2f1等位点存在功能性环相互作用。

**发育阶段特异性3D基因组重塑伴随神经元成熟**
E13.5小鼠胚胎前脑和后脑分析显示，与E11.5相比，拟时序驱动的A/B区室动态在阶段间保守模式（与放射状胶质细胞/祖细胞程序相关）和阶段特异性模式（与兴奋性/成熟神经元标志物相关）。染色质环强度分析将分化相关基因与环接触强度变化关联。Zbtb20在E11.5放射状胶质细胞富集聚类中显示增强局部接触。Grin2b周围结构域在从放射状胶质细胞到分化神经元过程中逐渐减弱并分解为亚结构域，伴随表达增加。与Stereo-seq数据整合，通过kNN分类器和MOSCOT最优传输分析，验证了跨阶段聚类映射的稳健性，表明E11.5染色质组织携带与后期发育状态相关的信息。

**讨论与结论**
Spatial Hi-C-RNA填补了将3D基因组折叠与完整组织转录程序关联的空间原理空白。通过共分析3D基因组结构和基因表达，该技术揭示了结构性和转录程序如何共同指定细胞身份。在成年小鼠脑中，整合聚类解析了精细解剖结构，并鉴定出细胞类型特异性染色质特征。在黑素瘤中，空间染色质组织与肿瘤状态异质性相关，拟时序分析显示染色质重塑与转录状态转变同步。在发育胚胎中，联合轨迹揭示了协调的谱系成熟，伴随渐进性A区室激活和神经元环增强。与Stereo-seq整合进一步表明E11.5染色质状态保留了与后期E13.5空间组织相关的发育关系。该平台具有灵活的分辨率（10-20 μm）和捕获面积，可结合相邻切片其他模态（如Spatial ATAC-seq）进行整合分析。研究结论：这些发现确立了Spatial Hi-C-RNA作为在完整组织中绘制染色质-基因耦合的平台。通过以高空间分辨率整合染色质结构与转录，Spatial Hi-C-RNA提供了关于3D基因组组织如何在天然组织微环境中塑造细胞身份、发育轨迹和肿瘤进展的见解。该框架将促进未来研究整合染色质结构与其他空间模态、计算模型和组织病理学信息。