传统绵羊和牛凝乳奶酪中γ-酪蛋白等电点图谱的季节稳定性

《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：Seasonal resilience of γ-casein isoelectric profiles in traditional ewe’s and cow’s lump cheese

　　

乳蛋白的等电点（pI）是影响奶酪生产和乳制品真实性（authentication）可靠性的重要理化参数。尽管γ2-酪蛋白（γ2-casein）和γ3-酪蛋白（γ3-casein）被广泛用作区分牛和绵羊乳蛋白的物种特异性标记，但以往大多数研究主要集中于掺假（adulteration）的分析检测，而关于实际生产条件下γ-酪蛋白等电点图谱的季节稳定性的信息有限。因此，本研究调查了斯洛伐克生产季节期间生产的传统绵羊和牛凝乳奶酪中γ2-和γ3-酪蛋白含量和等电点在整个生产和泌乳期的时间及季节变化。研究人员使用Servalyte Focus Gel 3–10 24 S凝胶上的等电聚焦（IEF）分析了3月至10月期间收集的共92个奶酪样品（46个绵羊和46个牛）。在绵羊奶酪中，γ2-和γ3-酪蛋白含量和pI值在整个季节保持高度稳定（γ2-酪蛋白：0.82 mg·100 g?1，pI = 7.24；γ3-酪蛋白：0.71 mg·100 g?1，pI = 6.52），在监测的生产期间之间没有统计学显著差异（p > 0.05）。相比之下，牛奶酪表现出更大的季节变异性，夏季γ-酪蛋白pI值显著降低（p < 0.01）。这些发现表明，绵羊凝乳奶酪中γ-酪蛋白pI值受季节波动影响最小，支持其在实际生产条件下区分乳物种的适用性。总体而言，所获得的结果提供了关于在实际季节性条件下生产的传统乳制品中γ-酪蛋白等电点图谱时间稳定性的额外信息。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
乳制品真实性保障是生产者和监管机构面临的持续挑战，尤其对于具有高市场价值的传统奶酪。绵羊奶奶酪因羊奶季节性生产且价格远高于牛奶，特别容易受到经济掺假（adulteration）的影响——未申报性地用牛奶替代或部分替换羊奶会损害产品完整性、误导消费者，并可能对牛乳蛋白过敏人群构成健康风险。尽管某些条件下混合不同物种奶源在法律上允许，但未申报此类行为构成食品欺诈，尤其对受保护原产地名称（PDO）、受保护地理标志（PGI）或传统特产保证（TSG）等质量体系保护的奶酪尤为关键。目前，γ2-和γ3-酪蛋白通过等电聚焦（IEF）分离被广泛用作物种特异性标记，用于鉴别牛和绵羊乳蛋白，但以往研究多集中于掺假分析检测，而对实际生产条件下γ-酪蛋白等电点图谱的季节稳定性知之甚少。因此，本研究旨在评估传统绵羊和牛凝乳奶酪在整个生产季节中γ2-和γ3-酪蛋白含量及等电点（pI）的时间与季节变化，以确定γ-酪蛋白等电点图谱是否可作为稳健的真实性标记物。

**研究内容与结论**
研究人员在斯洛伐克一个小型乳品厂（Agrosú?a, a.s.，位于Dolná Sú?a）的2022年放牧季节（3月29日至10月26日）期间，连续生产并收集了46个绵羊凝乳奶酪样品和46个牛凝乳奶酪样品。将生产季节分为春季（3–5月）、夏季（6–8月）和秋季（9–10月）。采用基于官方欧盟参考方法（委员会实施条例(EU) 2018/150）改进的等电聚焦（IEF）方法，使用Servalyte Focus Gel 3–10 24 S预铸凝胶，结合AzureSpot软件进行光密度定量分析，测定γ2-和γ3-酪蛋白含量及pI值。统计分析采用非参数Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验。结果表明：绵羊奶酪中γ2-和γ3-酪蛋白含量和pI值在整个季节高度稳定（γ2-酪蛋白：0.82 mg·100 g?1，pI = 7.24；γ3-酪蛋白：0.71 mg·100 g?1，pI = 6.52），各生产期间无显著差异（p > 0.05）；牛奶酪中γ-酪蛋白pI值表现出显著季节变异性，尤其是夏季pI值显著降低（p < 0.01），而含量变化不显著。因此，绵羊凝乳奶酪中γ-酪蛋白等电点图谱受季节波动影响最小，适合作为实际生产条件下区分乳物种的稳健标记物，而牛奶酪则更易受环境因素影响。该研究发表在《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》期刊。

**主要关键技术方法**
研究人员采用等电聚焦（IEF）技术，基于官方EC参考方法并加以改进：使用Servalyte Focus Gel 3–10 24 S预铸凝胶（Serva, Germany），在SERVA HPE? BlueHorizon?系统上运行，伺服冷却至10°C。样品预处理包括酪蛋白提取和纤溶酶（plasmin）处理以从β-酪蛋白生成γ-酪蛋白片段，并用ε-氨基己酸抑制纤溶酶活性。IEF聚焦程序包括预聚焦和四个聚焦步骤。光密度分析使用AzureSpot软件（Azure Biosystems, USA）进行定量和pI校准。样品来源为斯洛伐克Dolná Sú?a的小型乳品厂，共92个样品（46个绵羊、46个牛），涵盖整个2022年生产季节。

**研究结果**
**Results of ewe's lump cheese**
通过IEF分析和非参数统计检验，发现绵羊凝乳奶酪中γ2-和γ3-酪蛋白含量呈现中等季节性波动（γ2-酪蛋白平均0.82 mg·100 g?1，γ3-酪蛋白平均0.71 mg·100 g?1），但无显著季节性差异（p > 0.05）。pI值高度稳定：γ2-酪蛋白pI范围7.09–7.50（均值7.24），γ3-酪蛋白pI范围6.41–6.67（均值6.52），变异系数分别约1.4%和1.1%，各季节间无显著差异（p > 0.05）。这表明绵羊γ-酪蛋白等电点图谱受季节影响极小。

**Results of cow's lump cheese**
牛凝乳奶酪中γ2-和γ3-酪蛋白含量同样呈现波动（γ2-酪蛋白平均0.83 mg·100 g?1，γ3-酪蛋白平均0.72 mg·100 g?1），但夏季含量下降，不过统计上不显著（p > 0.05）。然而，pI值表现出显著季节性差异：γ2-酪蛋白pI范围6.61–7.05（均值6.81），γ3-酪蛋白pI范围6.09–6.42（均值6.27），夏季pI值显著降低（p < 0.01），变异系数约1.8%。这表明牛γ-酪蛋白对夏季环境变化更敏感。

**讨论与结论**
讨论部分指出，γ-酪蛋白是通过纤溶酶（plasmin）介导的β-酪蛋白水解产生的蛋白水解片段，其积累在绵羊和山羊奶酪中比牛奶酪更快。本研究中绵羊奶酪γ-酪蛋白pI值（γ2-酪蛋白7.24，γ3-酪蛋白6.52）与已报道参考值（7.2和6.7）高度一致，且季节稳定性强；牛奶酪pI值（γ2-酪蛋白6.81，γ3-酪蛋白6.27）较低，夏季降低可能与热应激、饲养变化及泌乳阶段引起的纤溶酶活性改变有关。绵羊γ-酪蛋白图谱的稳定性可能反映小反刍动物对季节性环境波动的更强生理适应性。研究局限性包括：仅基于一个生产季节的单一年份数据，未直接监测环境变量和β-酪蛋白浓度及纤溶酶活性，且统计方法未能完全考虑纵向层次结构。总体而言，结果表明绵羊凝乳奶酪中γ-酪蛋白等电点图谱在实际生产中足够稳定，支持其作为传统奶酪真实性检测的稳健生物标记物。

**结论**（翻译）
本研究证明，在实际农场条件下生产的传统绵羊和牛凝乳奶酪中，γ2-和γ3-酪蛋白等电点图谱在整个季节性生产和泌乳期表现出不同的时间行为。绵羊凝乳奶酪在整个生产季节中γ-酪蛋白含量和pI值保持高度稳定，而牛凝乳奶酪在监测的生产季节中表现出显著更大的时间变异性，尤其是夏季期间。这些发现可能表明绵羊γ-酪蛋白图谱对季节性乳生产相关的环境和技术影响具有更强的抵抗力。本研究扩展了以往侧重于真实性检测的研究，表明γ-酪蛋白等电点在实际季节性生产条件下保持足够稳定，尤其在传统绵羊奶奶酪中。这种稳定性支持γ2-和γ3-酪蛋白作为发酵奶酪产品中乳真实性检测和物种来源验证的稳健生物标记物。从实践角度看，γ-酪蛋白等电聚焦是一种相对简单、快速且成本效益高的分析方法，适用于传统乳制品的常规筛查。所获得的结果可能有助于改善真实性控制、保护传统奶酪生产并增强消费者对高经济价值区域乳制品的信心。