Brachyury表达水平预测体外来源的神经中胚层祖细胞的谱系潜能和轴形成能力

《PLOS Biology》：Brachyury expression levels predict lineage potential and axis-forming ability of in vitro-derived neuromesodermal progenitors

　　

摘要：神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitors，NMPs）在延长的前后轴中产生脊髓和肌肉骨骼系统。在体内，NMPs具有双重潜能，与共同表达SOX2和Brachyury（TBXT）的区域一致。在体外，SOX2/TBXT共表达细胞可从多能细胞产生，并且与体内对应物一样，可以产生神经管和体节中胚层。然而，体外SOX2/TBXT共表达细胞的功能特征仍不清楚，这阻碍了与体内数据的比较。为了解决这一问题，研究人员开发了一种双Sox2/Tbxt报告基因小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC）系。SOX2/TBXT报告基因阳性细胞在体外从多能群体中出现，其动态变化反映了它们在胚胎中的出现。纯化的SOX2/TBXT共表达群体可以分化为神经外胚层或中胚层，包括在BMP刺激下形成侧板中胚层。在类胚体中，定量活体成像显示，WNT或NOTCH抑制迅速导致TBXT表达下调和轴向延伸减弱。研究人员发现，克隆性铺板的SOX2/TBXT共表达细胞是具有自我更新能力的双潜能NMPs。通过将克隆分析（clonal analysis）与数学推断（mathematical inference）相结合，研究人员确定了TBXT和/或SOX2表达的两个阈值，将克隆输出从神经偏向切换到中胚层偏向，再从中胚层偏向切换到中胚层特化。胚胎NMPs的图像分析支持一个模型，即SOX2和TBXT独立影响神经中胚层分化。因此，这种Sox2/Tbxt双报告基因细胞系揭示了NMPs中未被发现的异质性，并连同胚胎SOX2/TBXT水平的图像分析，挑战了神经中胚层命运选择主要受SOX2/TBXT相互拮抗调控的假设。

**论文解读：Brachyury表达水平预测体外来源的神经中胚层祖细胞的谱系潜能和轴形成能力**

**研究背景、问题与研究目的**

在脊椎动物胚胎发育过程中，前后（anteroposterior，AP）体轴的形成依赖于一类被称为神经中胚层感受态细胞（neuromesodermal competent cells，NMCs）的短暂祖细胞群体。这些细胞在轴延伸后期产生轴旁中胚层和神经外胚层。其中，真正的双潜能神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitors，NMPs）的标志是同时具有向神经外胚层和中胚层两个不同胚层分化的能力。体内实验表明，具有神经中胚层命运的细胞位于胚胎后端，该区域与转录因子SOX2和Brachyury（TBXT）的共表达区域重叠。在体外，利用成纤维细胞生长因子（FGF）和WNT信号处理多能干细胞，可以产生表型和功能上类似体内NMCs的细胞，其中高比例细胞共表达SOX2/TBXT，并且这些群体能够分化为神经和中胚层谱系。然而，体外SOX2/TBXT共表达细胞的功能特征仍不清楚，特别是单个细胞是否真正具有双潜能，以及SOX2和TBXT表达水平的异质性如何决定分化命运。以往的研究使用了破坏基因功能的敲入报告基因或细菌人工染色体转基因，存在表达不准确或功能干扰的风险。因此，需要一种最小化干扰的双报告基因系统来研究体外NMPs的细胞行为、群体异质性和功能潜能。本研究旨在通过构建一种新型双报告基因小鼠胚胎干细胞（mESC）系，解决上述问题，并探讨TBXT表达水平如何预测谱系潜能和轴形成能力。

**研究内容与结论**

研究人员通过CRISPR敲入技术构建了SOX2::mCherry；TBXT::GFP双报告基因mESC系（STR-KI），该细胞系保留了内源基因的完整开放阅读框，最小化了对蛋白质功能的干扰。通过体内嵌合体实验和体外分化实验，验证了报告基因的忠实性。研究发现，在体外NMP分化过程中，SOX2⁺细胞首先获得TBXT表达，这与体内NMPs的起源一致。通过流式分选和克隆分析，研究人员证实SOX2/TBXT共表达细胞是真正的双潜能NMPs，并具有自我更新能力。更重要的是，TBXT-GFP的表达水平存在两个阈值：低阈值决定神经偏向与中胚层偏向的转换（N-M偏向转换阈值），高阈值决定中胚层特化（中胚层特化阈值）。此外，在类胚体（gastruloid）模型中，WNT或NOTCH抑制会迅速导致TBXT表达下调和轴向延伸减速，表明TBXT是轴延伸的关键驱动因子。通过体内图像分析，研究人员发现SOX2和TBXT的梯度模式并不符合简单的相互拮抗模型，而是各自提供独立的位置信息，其中TBXT在预测细胞命运方面起主导作用。该研究发表在《PLOS Biology》。

**主要技术方法**

1. **CRISPR敲入转基因技术**：构建SOX2::mCherry；TBXT::GFP双报告基因mESC系（STR-KI），通过同源重组替换内源基因终止密码子，保留完整蛋白质功能。
2. **流式细胞术与荧光激活细胞分选（FACS）**：根据SOX2-mCherry和TBXT-GFP荧光强度分选不同亚群，进行基因表达分析（qRT-PCR）和克隆培养。
3. **单细胞克隆分析与数学推断**：将分选的单个细胞铺板于不同基质（纤维连接蛋白、明胶、Geltrex、Matrigel），5天后通过免疫荧光和高内涵显微镜分析克隆谱系输出，并建立数学模型拟合分化动力学。
4. **类胚体（gastruloid）培养与定量活体成像**：将STR-KI mESCs聚集形成类胚体，使用WNT抑制剂（IWP-2）或NOTCH抑制剂（LY411575）处理，每小时采集共聚焦图像，通过图像分割和信号提取分析TBXT/SOX2动态与轴延伸的关系。
5. **体内图像分析与空间梯度建模**：对E8.5小鼠胚胎进行SOX2和TBXT免疫荧光共聚焦成像，计算2D投影中的梯度方向、陡度、位置误差和归一化互信息（NMI），评估蛋白质表达与命运边界的对应关系。

**研究结果**

**1. 新型报告基因细胞系STR-KI准确报告SOX2和TBXT表达及体外NMP分化轨迹**
通过CRISPR敲入构建了STR-KI mESC系，报告基因荧光与内源蛋白高度相关（SOX2-mCherry R2=0.894，TBXT-GFP R2=0.838）。嵌合体胚胎显示正常表型，报告基因表达模式与体内一致。体外分化流程中，从多能干细胞（Sox2mCh^high）经拟胚体样状态（Sox2mCh^low）后，在第三天出现Sox2mCh^pos/TbxtGFP^pos双阳性细胞，约占群体的67%。

**2. 体外Sox2和Tbxt表达动态与体内NMP出现相匹配**
通过对E6.5-E8.0小鼠胚胎的免疫荧光分析，发现NMPs在体内起源于SOX2⁺TBXT^-的细胞群体，随后获得TBXT表达。这与体外分化中SOX2⁺细胞先出现再获得TBXT的过程一致。

**3. 体外来源的Sox2mCh/TbxtGFP共表达细胞是NMCs**
通过qRT-PCR分析不同荧光亚群，发现Sox2mCh^pos/TbxtGFP^low细胞保留NMC标志物，而Sox2mCh^pos/TbxtGFP^high细胞富集中胚层标志物（如Wnt3a、Tbx6）。进一步分选培养后，Sox2mCh^pos/TbxtGFP^low细胞可产生神经和中胚层后代，而Sox2mCh^pos/TbxtGFP^high细胞主要走向中胚层。RNA测序分析证实，TbxtGFP^pos细胞分化为中胚层，Sox2mCh^pos细胞在FGF单独处理下分化为神经，而WNT激活抑制神经分化。此外，低TBXT表达的NMCs对BMP4处理有反应，可产生侧板中胚层（LPM）和内皮样结构。

**4. STR-KI细胞活体成像揭示TBXT在WNT和NOTCH驱动的轴延伸中的作用**
在类胚体模型中，WNT抑制剂（IWP-2）或NOTCH抑制剂（LY411575）处理导致轴延伸在2-3小时内显著减速，同时TbxtGFP信号在NMP区域迅速下降（约2-3小时），而Sox2mCh信号在10-15小时后才出现增加。这表明轴延伸主要由Tbxt表达细胞驱动，且WNT和NOTCH信号直接维持TBXT表达。

**5. 体外NMCs的克隆示踪揭示依赖于基质和TBXT水平的NMP谱系偏向**
单细胞克隆实验显示，Sox2mCh^pos/TbxtGFP^pos细胞在克隆水平上具有双潜能，且能自我更新。高TBXT表达（TbxtGFP^high）的细胞更倾向于产生中胚层，且在不同基质上存活率更高。通过数学推断，研究人员确定了两个TBXT表达阈值：一个约在1745任意单位（AU）的“N-M偏向转换阈值”，低于该阈值偏向神经，高于则偏向中胚层；另一个更高水平的“中胚层特化阈值”，超过该阈值几乎只产生中胚层。基质（如Matrigel）可调节这种偏向，但阈值效应依然存在。SOX2水平或SOX2/TBXT比值对偏向预测效果不如单独TBXT水平。

**6. 体内TBXT和SOX2空间模式为NM命运区域提供独立信息**
对E8.5小鼠胚胎尾侧外胚层的3D共聚焦图像分析显示，SOX2形成大致平行于AP轴的线性梯度，而TBXT形成非线性的对角V形梯度。两者梯度方向在大部分区域不重合，仅在 midline 处近似对齐。位置误差分析表明，TBXT在ML轴上的NM-M和NM-N边界附近具有更高的精度（2-3个细胞宽度），而SOX2仅在NM-M边界处有峰值精度（3-4个细胞宽度）。归一化互信息（NMI）分析显示，在ML轴上，TBXT比SOX2或log比值携带更多关于N与NM、M与NM命运的信息。只有同时考虑TBXT和SOX2作为独立变量，才能准确“三角定位”细胞在AP和ML轴上的位置。

**总结与讨论**

本研究通过最小化干扰的双报告基因mESC系，证实了体外SOX2/TBXT共表达细胞是真正的双潜能NMPs，并揭示了TBXT表达水平以两个阈值方式调控谱系偏向：低阈值（约1745 AU）决定神经-中胚层偏向转换，高阈值决定中胚层特化。基质环境可调节偏向程度，但不改变阈值效应。体内图像分析支持SOX2和TBXT提供独立的位置信息，而非简单的相互拮抗，TBXT在预测细胞命运方面起主导作用。该研究挑战了NMP命运选择主要由SOX2/TBXT相互拮抗控制的传统模型，提出了一个基于TBXT剂量和独立输入信息的调控框架。这些发现对于理解体轴延伸的分子机制以及利用干细胞模型模拟发育过程具有重要意义。