甲酸盐和钠离子依赖的Wood–Ljungdahl途径参与Tepidanaerobacter acetatoxydans的有机营养、无机营养和甲基营养生长

《Environmental Science & Technology》：Formate- and Sodium Ion-Dependent Wood–Ljungdahl Pathway Involved in Organo-, Litho-, and Methylotrophic Growth of Tepidanaerobacter acetatoxydans

　　

沼气池产甲烷是替代化石燃料作为能源的一种有前景的途径。产甲烷作用的主要底物之一是乙酸，它被乙酸分解型产甲烷菌直接利用。在高pH和高铵浓度下，乙酸分解型产甲烷作用受到抑制，乙酸被氧化为H₂和CO₂，这些产物随后被氢营养型产甲烷菌利用。研究人员于2011年从这样一个消化池中分离出耐铵的互养乙酸氧化细菌Tepidanaerobacter acetatoxydans（Westerholm等），但其生理学及其在沼气池中的作用仍相对未知。研究人员证明，T. acetatoxydans是一种产乙酸菌，利用一种不寻常的Wood–Ljungdahl途径（WLP），该途径缺乏甲酸脱氢酶（Fdh）。因此，T. acetatoxydans不能发酵葡萄糖、H₂ + CO₂或CO + CO₂，但添加甲酸盐可恢复产乙酸作用。T. acetatoxydans也能在WLP中氧化甲基基团进行生长，但由于缺乏甲酸脱氢酶，甲基基团被不完全氧化为甲酸盐，而非以CO₂作为终产物。本研究为缺乏甲酸脱氢酶的产乙酸菌的生理学提供了新见解，并揭示了T. acetatoxydans在沼气池食物网中的新作用。

**论文解读：Tepidanaerobacter acetatoxydans中甲酸盐和钠离子依赖的Wood–Ljungdahl途径及其在有机营养、无机营养和甲基营养生长中的作用**

**研究背景与问题**

在气候变化背景下，寻找新型可再生能源是社会面临的重大挑战之一。沼气池通过有机废弃物产生甲烷（CH₄），是化石燃料的替代方案。在沼气池中，复杂有机物首先被初级降解者水解，单体进一步发酵为醇、酸、H₂和CO₂，这些化合物可被产甲烷古菌和产乙酸菌交叉喂养。产甲烷菌通常利用H₂ + CO₂，部分可利用甲基基团或乙酸；而产乙酸菌底物谱更广，包括C1底物（H₂ + CO₂、甲基基团、甲酸盐、CO）及多种有机底物。产乙酸菌的核心特征是拥有Wood–Ljungdahl途径（WLP），该途径由甲基分支和羰基分支组成，将两分子CO₂还原为乙酰辅酶A（acetyl-CoA）并最终生成乙酸。在甲基分支中，CO₂先被还原为甲酸盐，再与四氢叶酸（THF）结合并还原为甲基基团；羰基分支中，另一分子CO₂被还原为CO，与CO脱氢酶/乙酰辅酶A合酶复合体（CODH/ACS）结合催化乙酰-CoA合成。

乙酸是沼气池食物网中的核心中间物，也是甲烷的前体。乙酸可通过两条途径产生甲烷：乙酸分解型产甲烷菌直接裂解乙酸，或通过互养乙酸氧化（SAO）途径，由一组细菌将乙酸氧化为CO₂和H₂，再由氢营养型产甲烷菌利用。当高蛋白废物进入消化池时，发酵释放铵并提高pH，抑制乙酸分解型产甲烷菌，使互养乙酸氧化成为主要途径。2011年，从高铵消化池中分离出Tepidanaerobacter acetatoxydans，它具有迄今报道的最高氨耐受性（高达1 M）。先前研究报道T. acetatoxydans能利用葡萄糖但生长极差，仅产生乙酸，且基因组显示所有WLP基因除甲酸脱氢酶（Fdh）编码基因外均存在，但缺乏对WLP活性的直接证据。本研究旨在阐明T. acetatoxydans的生理学特征，特别是其WLP的运作方式、能量保存机制以及其在沼气池食物网中的角色。

**研究方法**

研究人员采用菌株T. acetatoxydans Re1（DSM 21804）进行培养，使用CO₂/KHCO₃缓冲的复合培养基，在45°C条件下培养。主要技术方法包括：制备静息细胞（resting cells）进行发酵实验，以排除生物量生产干扰；使用气相色谱测定乙酸和H₂，酶学试剂盒测定葡萄糖和甲酸盐，高效液相色谱（HPLC）测定丁香酸盐（syringate）；利用Na⁺特异性电极测量钠离子浓度；制备无细胞提取物（cell-free extract）并通过酶学测定法检测关键酶活性，包括亚甲基-THF脱氢酶、CO脱氢酶、氢化酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）和丙酮酸:甲酸裂解酶（PFL）的活性。此外，通过添加质子载体TCS和Na⁺离子载体ETH2120分析能量耦合离子。

**研究结果**

**1. 基因组序列推导的T. acetatoxydans代谢特征**
基因组分析显示，T. acetatoxydans的WLP编码基因位于一个基因簇中，而非像Acetobacterium woodii那样分布在三个簇中。该簇包含CODH/ACS复合体及甲基分支所有基因，但缺失甲酸脱氢酶基因。有趣的是，基因组中存在第二个编码相似甲基分支酶（无Fdh）的基因簇，且与多个甲基转移酶系统（MTI、CoP、MTII）编码基因相邻。此外，还编码甘氨酸合成途径（glycine synthase pathway）基因。能量保存方面，基因组编码一个Rnf复合体、一个电子歧化氢化酶以及两个A₁A_O型ATP合酶（一个Na⁺依赖型，一个H⁺依赖型），而非典型的F₁F_O ATP合酶。

**2. T. acetatoxydans在葡萄糖生长中需要外部甲酸盐**
仅以葡萄糖为底物时，T. acetatoxydans生长极差（生长速率0.006 ± 0.004 h^–1，终OD₆₀₀ 0.26 ± 0.08）。添加甲酸盐后，生长速率提高20倍（0.12 ± 0.01 h^–1），终OD增加近10倍（2.1 ± 0.1）。代谢物分析表明，葡萄糖和甲酸盐同时被消耗，产生乙酸（约47 mM）和少量H₂，发酵平衡为1葡萄糖+1.06甲酸盐→2.63乙酸+0.16 H₂。当甲酸盐浓度降至3 mM时，葡萄糖消耗在甲酸盐耗尽后停止，H₂产量增加。结果证实WLP作为葡萄糖氧化的电子汇，需要外部甲酸盐提供甲基分支起点。

**3. 静息细胞中葡萄糖发酵依赖于外部甲酸盐**
静息细胞实验进一步验证了上述发现。无甲酸盐时，葡萄糖发酵产生乙酸和H₂（1葡萄糖→1.94乙酸+3.81 H₂），WLP不活跃。添加甲酸盐后，两者同时消耗，产生更多乙酸和更少H₂（1葡萄糖+1.37甲酸盐→3.13乙酸+0.85 H₂），符合产乙酸菌通过WLP产生第三分子乙酸的典型特征。静息细胞不能利用H₂ + CO₂、甲酸盐+CO₂或CO+CO₂单独产乙酸，但添加甲酸盐后，H₂+CO₂或CO+CO₂可产乙酸，且1 mol甲酸盐消耗产生1 mol乙酸，再次证明甲酸盐依赖的WLP活性。

**4. 无细胞提取物中的酶活性**
在生长于葡萄糖+甲酸盐的细胞提取物中，检测到亚甲基-THF脱氢酶活性（2.17 ± 0.12 U mg^–1，以NADP⁺为电子受体）、CO:MV氧化还原酶活性（5.85 ± 0.41 U mg^–1，代表CODH/ACS复合体活性）和氢化酶活性（26.86 ± 2.74 U mg^–1）。未检测到甲酸脱氢酶活性。丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）活性为1.56 ± 0.10 U mg^–1，而丙酮酸:甲酸裂解酶（PFL）无活性，表明T. acetatoxydans通过PFOR代谢丙酮酸，而非PFL产生甲酸盐。

**5. T. acetatoxydans对甲基基团的利用**
由于基因组编码多个甲基转移酶系统，研究人员测试了T. acetatoxydans对甲基化底物的利用。以丁香酸盐（4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸）为底物，T. acetatoxydans能生长（终OD₆₀₀ 0.18），仅产生乙酸，未检测到甲酸盐。静息细胞实验显示，在N₂/CO₂气氛下，丁香酸盐被消耗，产生乙酸和甲酸盐，发酵平衡为1丁香酸盐+1.24 CO₂→1.24乙酸+0.56甲酸盐。在H₂气氛下，甲酸盐不再产生，乙酸产量增加（1丁香酸盐+1.83 CO₂→1.83乙酸），表明H₂作为电子供体使甲基基团完全还原为乙酸。甲基基团通过WLP代谢，但缺乏Fdh导致不完全氧化为甲酸盐。

**讨论与结论**

研究结果表明，T. acetatoxydans拥有一个活跃但缺乏甲酸脱氢酶的WLP，这可能反映了其栖息地（沼气池）中甲酸盐的普遍存在。与其他类似产乙酸菌相比，如Clostridium bovifaecis需要外部甲酸盐，而Blautia luti利用PFL自产甲酸盐，T. acetatoxydans虽有PFL基因但无活性，因此依赖外部甲酸盐的交叉喂养。这种依赖使其在自然生境中必须依赖其他微生物提供的甲酸盐进行糖类发酵。同时，外部甲酸盐也允许其进行无机营养生长（如H₂ + CO₂产乙酸），这一过程依赖Na⁺作为能量耦合离子：Rnf复合体利用还原态铁氧还蛋白（Fd_red）氧化驱动Na⁺跨膜运输，再由Na⁺依赖的A₁A_O ATP合酶合成ATP。第二个H⁺依赖的ATP合酶可能参与pH稳态调节。

T. acetatoxydans在沼气池中可能扮演多重角色。作为互养乙酸氧化菌，它氧化乙酸时（反向WLP）由于缺乏Fdh，每摩尔乙酸仅产生1 mol CO₂、3 mol H₂和1 mol甲酸盐。甲酸盐与H₂具有相似的氧化还原电位，但甲酸盐溶解度更高，有利于长距离扩散，可被产甲烷菌利用。此外，T. acetatoxydans能利用植物材料中的甲氧基化芳香化合物（如丁香酸盐），通过脱甲基作用将甲基基团导入WLP。由于缺乏Fdh，甲基基团被氧化为甲酸盐（而非CO₂），释放的电子用于还原CO₂为CO，再与甲基基团缩合成乙酸。在H₂存在时，甲基基团完全还原为乙酸（“仅还原”模式）。在沼气池中，若存在产甲烷菌，甲基基团可能被完全氧化为甲酸盐和H₂（“互养氧化”模式），为产甲烷菌提供电子供体。

**结论翻译**：研究人员必须得出结论，利用甲氧基化芳香化合物使T. acetatoxydans成为生物消化池食物网中的重要参与者。在H₂作为外部电子供体存在时，T. acetatoxydans以“仅还原”模式将甲基基团完全还原为乙酸。然而，在沼气池中，由于产甲烷菌的存在，甲基基团可能以“互养氧化”模式被完全氧化为甲酸盐和H₂。因此，T. acetatoxydans在沼气池中的主要作用可能是互养乙酸氧化以及互养甲基基团氧化，产生甲酸盐和H₂作为产甲烷菌的电子供体。本研究为缺乏甲酸脱氢酶的产乙酸菌的生理学提供了新见解，并揭示了T. acetatoxydans在沼气池复杂食物网中的新角色。论文发表在《Environmental Science》。