综述：空间转录组学和蛋白质组学方法用于分析实体瘤中预后细胞群落

《Journal of Advanced Research》：Spatial transcriptomic and proteomic approaches for profiling prognostic cell communities in solid tumors

　　

背景：全面理解肿瘤微环境（TME）的复杂性和异质性对于推进癌症治疗至关重要。最近空间组学技术的进展为深入探索TME开辟了新途径。通过整合来自组学的高分辨率空间信息，空间组学能够系统地表征组织内各种细胞类型的空间分布及其相互作用网络，提供TME的全景视图。新兴研究强调，TME内的特定空间结构与癌症预后和治疗反应密切相关。综述目的：本综述聚焦于空间细胞分布模式或特征性细胞结构及其与癌症预后的关系，强调空间异质性在肿瘤中的关键作用。旨在为预后评估和疗法设计中的精准医学方法提供理论基础。关键科学概念：本综述讨论了空间转录组学和蛋白质组学如何提取空间指标，包括细胞密度、邻近性和群落水平组织。研究人员进一步总结了细胞的空间分布模式和关键细胞群落结构，强调空间异质性在肿瘤中的关键作用。此外，它突出了与患者结局密切相关的关键空间特征，包括免疫细胞浸润模式和血管生态位。另外，本综述讨论了空间组学在临床应用中的挑战和未来前景。随着该领域的发展，空间组学具有变革肿瘤学研究的潜力，能够实现风险分层的新方法并改善患者结局。

1. 引言
肿瘤微环境（TME）的复杂性和异质性被视为有效治疗癌症的主要障碍。TME包含免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞类型，它们与肿瘤细胞动态相互作用，形成影响肿瘤生长和转移的复杂网络。空间组学技术（如空间转录组学和蛋白质组学）通过整合单细胞分子表达数据与高分辨率空间信息，能够绘制组织生态系统图谱，揭示细胞间相互作用网络，并阐明特定空间结构在癌症发生和进展中的作用。这些发现为揭示肿瘤异质性、优化治疗策略和改善患者预后提供了新见解。

2. 空间组学技术概述
空间组学涵盖空间转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观基因组学和基因组学。本综述聚焦于空间转录组学和蛋白质组学技术，整合概述其方法原理、分析流程、空间结构指标及临床应用。

2.1. 空间转录组技术
2.1.1. 基于原位杂交的技术：包括MERFISH、SeqFISH+和RNAscope，利用荧光标记核酸探针与靶RNA杂交，通过多轮成像实现亚细胞分辨率。优点包括高检测灵敏度和分辨率，其中RNAscope与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本兼容。局限性在于通量受限和技术复杂性，MERFISH虽通过编码策略实现千级基因通量，但需预定义探针，无法进行无偏全转录组发现。
2.1.2. 基于原位测序的技术：以STARmap为代表，直接在组织中进行测序反应，读取RNA分子及其空间坐标。优点包括高通量检测（>10,000靶标）、单细胞分辨率和三维空间映射能力。局限性包括依赖高效原位扩增易产生偏差，实验流程复杂，对样本RNA完整性要求严格。
2.1.3. 基于空间条形码的下一代测序（NGS）技术：包括10x Visium、Stereo-seq和Slide-seqV2。原理是将空间条形码寡核苷酸与组织释放的mRNA结合，进行文库制备和高通量测序。10x Visium技术成熟稳定，但分辨率限于多细胞点级。Stereo-seq和Slide-seqV2实现亚细胞或近单细胞分辨率，同时保持全转录组覆盖，但低丰度转录本捕获效率较低。
2.1.4. 其他专门技术：包括Tomo-seq、ZipSeq和TIVA，分别适用于低成本三维转录组重建、活组织实时标记和捕获mRNA以揭示瞬时转录状态。这些技术通用性有限，标准化程度低。

2.2. 空间蛋白质组技术
2.2.1. 基于免疫荧光的技术：包括循环染色技术（如t-CyCIF、Cell DIVE）、DNA条形码技术（如CODEX/PhenoCycler-Fusion）、信号放大技术（如Immuno-SABER、OPAL）和多重免疫荧光（mIF）。这些技术通过不同机制实现多蛋白的同步检测和空间定位，但存在成像周期长、荧光淬灭、或需要专门设备等限制。
2.2.2. 基于质谱的技术：包括成像质谱流式（IMC）和MALDI-MSI。IMC使用金属同位素标记抗体，通过激光剥蚀和质谱检测，避免荧光串扰，可同时检测40–50种蛋白。MALDI-MSI采用无标记策略，进行无偏、高通量（>1,000种蛋白）发现，但灵敏度较低。
2.2.3. 其他空间蛋白质组技术：如DNA条形码抗体可视化（DVP）和纳米液滴处理（NanoPOTS），分别实现抗体非依赖性检测和超灵敏分析，但技术复杂且需要专门设备。

2.3. 整合的空间转录组学和蛋白质组学平台（共检测平台）
整合平台包括高分辨率原位成像平台（如CosMx SMI、Xenium Protein）和高多重空间条形码平台（如GeoMx数字空间分析器（DSP））。原位成像平台将数千个RNA转录本和数十种蛋白定位到亚细胞区室，而DSP优先考虑多重能力，能够从选定感兴趣区域（ROI）中分析全转录组和超过1,000种蛋白。Visium CytAssist平台通过整合蛋白检测扩展了传统空间转录组学工作流程。

2.4. 空间多组学分析流程
2.4.1. 基于空间条形码的NGS分析：包括原始数据预处理和质量控制（QC）、批次效应校正、基因表达归一化与降维聚类、空间域识别和细胞类型注释。常用工具包括Space Ranger、STARsolo、Giotto、Squidpy、Harmony、Seurat、BBKNN、SCTransform、spaNorm、BayesSpace、SpaGCN、Cell2location、SPOTlight、RCTD、Tangram等。还介绍了集成分析流程如standR、ASTRO、HERGAST、Stereopy、STASCAN和Open-ST。
2.4.2. 基于成像的空间蛋白质组分析：包括图像预处理与去噪（如IMC-Denoise、CATALYST）、数据质量控制和批次效应校正、细胞分割（如ilastik+CellProfiler、Mesmer/DeepCell、CellPose、StarDist、MIRIAM、MCMICRO、Cytokit）、标记物定量和聚类（如t-SNE、UMAP、PhenoGraph、FlowSOM、HistoCAT、ImaCytE）。还介绍了分析流程如IMC Segmentation Pipeline、IMCDataAnalysis/steinbock、nf-core/imcyto、MCMICRO和SIMPLI。
2.4.3. 整合分析：针对ROI平台（如GeoMx DSP）和单细胞分辨率平台（如CosMx SMI），分别采用跨模态相关分析、多组学因子分析（如MOFA+）或统一细胞分割、多模态细胞聚类（如WNN、TotalVI）等方法。空间细胞通讯推断工具如CellChat和Giotto可用于整合空间邻近性与配体-受体表达模式。

2.5. 细胞架构的空间指标：细胞邻域、密度和距离
2.5.1. 细胞邻域（CN）：分为基于单细胞和基于区域的定义。基于单细胞的方法以每个细胞为中心，通过固定半径或k近邻定义邻域，计算组成向量后聚类。基于区域的方法将组织划分为规则网格或病理学区域，计算区域级组成向量后聚类。常用工具包括histoCAT、imcRtools、CytoMAP、Squidpy等。CN下游分析包括Niche-DE和Niche-LR鉴定邻域特异性差异表达基因和配体-受体信号。
2.5.2. 细胞密度：包括全局/区室密度（如免疫评分（Immunoscore）、基质肿瘤浸润淋巴细胞（sTIL）评分）和局部密度与热点分析。密度分析提供细胞丰度的定量基础。
2.5.3. 细胞距离：常用指标包括最近邻距离、固定相互作用半径内的邻域计数和抑制指数（如累积抑制指数（CSI））。这些指标量化肿瘤-免疫相互作用强度和空间排斥。

2.6. 空间特征与预后关联分析
通常采用单变量Kaplan-Meier（KM）分析和多变量Cox比例风险模型，评估空间特征对预后的独立预测价值。例如，免疫评分在结直肠癌中显示高评分与显著改善的无病生存和总生存相关。

3. 细胞群落与临床结局的关系
3.1. 细胞邻域（CN）：包括免疫活性CN（富集细胞毒性CD8⁺ T细胞、辅助CD4⁺ T细胞和B细胞）和免疫抑制性CN（富集调节性T细胞（Tregs）、癌相关成纤维细胞（CAFs）、SPP1⁺巨噬细胞等）。CN中的细胞密度和细胞距离也显著影响预后。例如，PDAC中CD8⁺ T细胞与肿瘤细胞距离越短，生存期越长；M2巨噬细胞距离越近，无病生存期越短。
3.2. 免疫细胞浸润模式：分为免疫炎症型、免疫荒漠型和免疫排斥型。免疫炎症型通常对免疫检查点阻断（ICB）治疗反应良好，但部分肿瘤存在T细胞耗竭和抗原呈递缺陷。免疫荒漠型免疫浸润极少，对ICB治疗反应差。免疫排斥型免疫细胞局限于肿瘤周围或基质，与成纤维细胞介导的物理屏障和趋化因子信号不足有关。
3.3. 三级淋巴结构（TLS）：TLS是慢性炎症条件下在非淋巴组织中形成的淋巴细胞聚集体，包含B细胞、T细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh）、高内皮微静脉（HEVs）和树突状细胞。TLS的成熟度和分布位置（瘤内或瘤周）显著影响预后。成熟TLS通常与良好预后相关，而瘤内TLS多预示较好结局，瘤周TLS效应因癌种而异。
3.4. 肿瘤血管：肿瘤血管显示功能性和结构性异常，包括微血管密度（MVD）升高和血管结构畸形。高MVD常与较差预后相关，但部分研究结果相反。血管形态（如卷曲毛细血管）也与预后相关。肿瘤干细胞（CSCs）与血管生成之间存在双向反馈促进肿瘤进展。

4. 空间组学的临床转化
4.1. 当前临床应用：基于传统H&E染色的计算病理学已更快速整合临床，如AI模型CHIEF和Prov-GigaPath。空间组学与AI的结合在NSCLC和iCCA中展示了预后预测潜力，例如通过IMC和深度学习预测术后进展。
4.2. 临床应用挑战：包括成本高、技术复杂、缺乏行业标准、数据兼容性差、肿瘤异质性、样本量不统一等。为促进可重复性和临床转化，需建立标准化操作程序（SOP）、严格质量控制、统一数据格式和开源分析流程，以及独立外部验证。
4.3. 临床应用前景：空间组学有望通过高分辨率解析TME空间结构，识别关键驱动因素，制定个体化治疗方案，提高治疗精准性，改善患者结局。未来可能出现统一的数据分析平台，简化流程，促进跨平台数据整合。

5. 结论
空间组学技术为揭示TME的复杂性和异质性提供了新方法。通过整合空间位置信息与分子表达谱，研究人员能够深入理解不同细胞类型在肿瘤中的作用，阐明空间结构对预后的关键影响。这不仅对基础癌症研究意义重大，也为临床实践提供新工具，有助于优化诊断、预后评估和个体化治疗策略。随着技术持续进步，空间组学有望进一步推动癌症研究，最终改善患者治疗结局和生存预后。