环境基质中广泛PFAS疑似筛查和半定量工作流程的验证

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Validation of a Suspect Screening and Semi-Quantitation Workflow for Broad Suite of PFAS in Environmental Matrices

　　

随着疑似筛查分析在全氟和多氟烷基物质(PFAS)调查中的应用变得更加常规，方法的稳健性变得至关重要。工作流程中变异的可能原因包括日间、日内、分析师间和基质间差异。研究人员使用两种水基质、两种水平的内部加标以及一种水成膜泡沫(AFFF)加标，在四天和两名分析师之间评估重现性，每个样品进行三次重复分析。通过分析提取前和提取后加标的样品来评估样品提取。分析在液相色谱四极杆飞行时间质谱(LC-QToF/MS)系统上以电喷雾正负离子模式(ESI±)进行，随后进行数据分析和置信水平分配。EPA Method 1633与土壤中PFAS的传统提取方法之间的提取效率和目标及疑似PFAS检测数量比较表明，Method 1633提供了增强的灵敏度，并检测到显著更多和更广泛的PFAS，而两种方法共享许多常见检测物。在含有已知PFAS分析物混合物的提取前和提取后加标样品上评估准确性，发现假阳性率可接受。精密度在日内(88.9%至100%)、日间(95±4%)和分析师间(相对标准偏差0 – 0.5%)均可接受。对ESI正模式下分析的提取前和提取后加标样品的比较表明，WAX SPE小柱足以处理更广泛的分析物，包括两性离子和阳离子PFAS。本文的研究结果表明，用于疑似PFAS的疑似筛查工作流程，结合了稳健的提取和分析方法，能在多种变异来源（包括基质、分析师和日间差异）中提供可靠且可重复的结果。EPA Method 1633提供的增强灵敏度和更广的分析物覆盖范围，结合全面的数据处理和置信水平分配，支持Method 1633的样品提取方法适用于水和土壤基质中常规PFAS调查的疑似筛查分析。当前研究中针对更广泛疑似分析物采用的“专家选择替代物”半定量方法，展示了改进的准确性和可靠性，并降低了不确定性。总体而言，本研究强调了方法选择和验证对于实现高分辨率质谱分析工作流程后识别的疑似PFAS高置信度的重要性。

**论文解读：环境基质中广泛PFAS疑似筛查与半定量工作流程的验证**

**研究背景与问题**

全氟和多氟烷基物质(PFAS)是一类以CF₂亚基为特征的化合物，其C-F键强度高、稳定性好，导致环境中自然降解和修复困难。PFAS种类繁多，包括阴离子型（如羧酸和磺酸）、中性、阳离子及两性离子型。现有环境实验室认证方法主要针对24至40种目标PFAS分析物，通常采用固相萃取(SPE)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。然而，美国国家标准与技术研究院(NIST)等机构列出了超过5,000种PFAS化合物，当分析标准品无法商业获得时，需采用高分辨率质谱(HRMS)进行疑似筛查或非靶向分析(NTA)。其他替代方法包括燃烧色谱和¹⁹F-NMR用于总有机氟测量，以及总氧化性前体物(TOP)分析法。此外，一项近期LC可行性模型应用于约12,000种PFAS化合物，发现其中不到10%预测适于典型LC分析。环境PFAS来源包括水成膜泡沫(AFFF)、金属电镀、工业应用和消费品。2024年，美国环保局(EPA)针对饮用水中六种PFAS制定了最大污染物水平(MCLs)，包括PFOA和PFOS为4.0 ppt，PFHxS、PFNA和HFPO-DA为10 ppt。2025年5月，EPA宣布保留PFOA和PFOS的国家一级饮用水法规，但拟撤销并重新考虑PFHxS、PFNA、HFPO-DA（俗称GenX）及其与PFBS的混合危害指数的法规决定。健康咨询水平虽非强制执行，但建立了行业来源的责任，并需要法医工具来识别和区分特定污染区的来源。PFAS源“指纹”包括各类PFAS的存在、支链异构体以及特定哨兵化合物浓度比。HRMS技术将可检测PFAS空间扩展到已发布的靶向方法（如EPA Method 1633）中的40种化合物之外。随着环境中PFAS种类不断增多，需要能捕获广泛两性离子、阳离子和阴离子PFAS的全面提取和分析方法。针对土壤基质开发了穷尽提取法（土壤提取[SE]法），但该方法繁琐且未商业化。EPA Method 1633于2021年作为草案发布，2024年发布最终版本，在此之前，商业化实验室使用修改的EPA Method 537.1。因此，当时需要一种能捕获广泛PFAS分析物的提取程序。弱阴离子交换(WAX) SPE通常被认为只靶向阴离子PFAS，但其pKa接近8，根据提取条件，两性离子PFAS可能通过阴离子交换和疏水作用分配到WAX SPE上。先前研究使用WAX SPE提取地下水，观察到两性离子(6:2 FTAB)和阳离子(6:2 FTSAm)回收率高于50%。HRMS的精确质量数分析使先进处理技术成为可能，如质量缺陷过滤和Kendrick质量缺陷(KMD)分析。KMD方法基于CF₂重复单元，对电化学氟化(ECF)和氟调聚物(FT)产生的PFAS具有独特质量差异。在非靶向HRMS结果交流中，需要基于质谱标准的置信水平。Schymanski等人(2014)首次提供了置信水平指导，Charbonnet等人(2022)扩展了针对PFAS的子水平。Jacob等人(2021)使用三种独立软件包优化了针对PFAS的疑似工作流程，以灵敏度和选择性大于70%为优化标准。由于HRMS在环境样品中的疑似筛查和NTA应用日益增多，需要可靠的半定量方法。许多研究发布了半定量策略，但数据获取、处理和数学建模存在差异，包括内部标准归一化方法的不同。“全局”选择法使用所有靶标内部标准，适用于缺乏明确结构鉴定的分析物，但不确定性高；“专家选择”内部标准提高了预测准确性，但降低了可靠性。当无常见内部标准且化学结构已知时，可预测电离效率用于浓度估计。常见方法包括使用靶标化合物校准曲线进行逆预测，或使用bootstrap模拟估计群体响应因子百分位数。Capitain等人(2025)利用基质匹配半定量法，将PFAS分为四个亚类，显著提高了准确性。由于已发表方法存在差异，需要统一半定量策略以最小化基质间变异。Pu等人(2024)开发了性能指标以交流靶向、疑似和NTA工作流程的准确性、不确定性和可靠性。疑似筛查工作流程依赖于质谱库或同行评审报告中的PFAS列表，通常包含5,000至11,000种化合物。Newton等人(2025)使用随机森林模型预测了11,827种PFAS的LC-MS可行性，发现正负模式下仅分别约9%和5%的化合物可能适用。因此，本研究中研究人员使用一个包含约600种在正负电离模式下检测到的疑似PFAS化合物的子集列表，该列表基于文献报道的分析物、LC-HMS可行性和现有数据库，并经过专家化学直觉筛选，以减少处理时间和假阳性(FP)检测。本研究的主要目标是评估水基质和土壤基质中PFAS分析物的准确性、精密度、重现性，使用内部实验室控制加标混合物和含有广泛PFAS化合物的AFFF，并在ESI正负模式下检测。此外，通过水验证了解日间、日内和分析师间变异，并比较水和土壤基质的方法性能。比较两种土壤提取方法（EPA Method 1633和文献SE法）对600种疑似PFAS的提取效率，并通过bootstrap模拟方法进行半定量，报告半定量方法的性能指标（准确性、不确定性和可靠性）以实现标准化和可比性。

**关键技术与方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：1) 使用液相色谱四极杆飞行时间质谱(LC-QToF/MS)系统，在电喷雾正负离子模式(ESI±)下进行分析；2) 样品前处理采用弱阴离子交换(WAX)固相萃取(SPE)小柱（结合石墨化碳黑[GCB]）进行预浓缩，遵循EPA Method 1633流程；3) 数据后处理使用Waters UNIFI软件进行峰处理、质量缺陷过滤（0.85-1.15）、质荷比误差(±10 mDa)过滤、空白扣除（响应≥3倍空白）以及同系物系列分组（基于Kendrick质量缺陷[KMD]重复单元CF₂，49.99681 m/z）；4) 半定量采用bootstrap模拟方法，以“专家选择替代物”为校准依据，计算响应因子(RF)百分位数，并评估准确性（绝对准确性商数[AAQ]）、不确定性（置信限倍数范围[CLFR]、上置信商数[UCQ]、下置信商数[LCQ]）和可靠性（上可靠性百分比[URP]、下可靠性百分比[LRP]、总体可靠性百分比[ORP]）。样本来源包括Milli-Q水和地下水（从Battelle实验室收集），以及AFFF（3M Light Water?配方，由未披露客户捐赠）；土壤样品来自AFFF污染的壤土和砂土。

**研究结果**

**3.1 水验证**
**3.1.1 提取前与提取后加标样品间的提取效率、准确性和精度及基质比较**
通过评估49种分析物加标在两种浓度水平、两种水基质中的真阳性(TP)、假阴性(FN)和假阳性(FP)计数。灵敏度（工作流程注释存在PFAS的能力）和选择性（限制注释不存在PFAS的能力）随置信水平(CL)降低（从CL 1到CL 4）而变化：低浓度(25 μg/L)样品选择性更高但灵敏度较低，高浓度(100 μg/L)样品灵敏度更高但选择性下降。例如，在提取前加标低浓度地下水中，CL 1-2b注释的PFAS选择性为97%，灵敏度为70%；在高浓度样品中，选择性和灵敏度分别为85%和93%。提取前后加标对灵敏度影响极小，选择性随CL提高而改善。提取前加标在纯水中通常降低选择性，但在地下水中未观察到这一效应。研究人员发现地下水基质的选择性优于纯水，可能由于分析顺序导致的经验差异。对于CL 1化合物（靶标PFAS），选择性为100%，但灵敏度约50%，因为仅27种分析物作为靶标用于HRMS分析，而计算基于49种加标物。地下水样品的灵敏度和选择性在70%以上时被认为处于优化范围。

**3.1.2 纯水中天然PFAS加标回收率**
在提取前加标纯水样品中，低浓度样品检测到42种PFAS（回收率86%），高浓度样品检测到45种（回收率92%）。低浓度样品中检测数较少，可能由于提取或数据采集过程中的损失（如吸附于聚丙烯管壁或电离效率低）。常见FP包括PFHxSaAm、N-TAmP-FASAP C6等；常见FN包括PFBA和3:3 FTCA。在提取后加标样品中，低浓度和高浓度分别检测到42种和46种PFAS，回收率分别为86%和94%。

**3.1.3 地下水中天然PFAS加标回收率**
在提取前加标地下水样品中，低浓度检测到40种PFAS（82%），高浓度检测到46种（94%）。常见FP包括PFHxSaAm、N-MeFPeSAA和N-SPAmP-FASAPS C7；常见FN包括8:2 FTAcr、NFDHA和PFMOPrA。提取后加标样品中，低浓度和高浓度分别检测到40种和46种PFAS，回收率分别为82%和94%。

**3.1.4 日内、日间和分析师间变异的精密度**
精密度通过识别数量衡量。49种加标天然PFAS的提取前回收率：纯水为86±1%至92±0%，地下水为82±0%至94±1%；提取后回收率范围相似。单个分析师内和分析师间PFAS识别重现性分别为0-2%和0-0.5%。日内标准回收率为95±4%，日间回收率（四天）范围为88.9%至100%，最大变异出现在第4天。

**3.1.5 基于假阳性识别规则**
回顾性数据分析显示，大多数FP识别发生在正离子模式下，针对当时无标准品的阳离子或两性离子PFAS。FP来源包括：结构异构体错误分配、保留时间不一致、同位素误识别以及光谱库覆盖限制。例如，PFPrOPrA被错误识别为GenX（醚氧位置异构体）；FHpSA因与PFHpA保留时间相近但响应差异而被确认为FP；N-MeFHxSAA被确认为PFDA的¹³C同位素脱羧产物；N-TAmP FASAP C6与6:2 FTAB的结构差异可通过保留时间校正。研究人员强调结合MS/MS碎片模式和同系物保留时间关系对减少FP至关重要。

**3.1.6 纯水样品中AFFF加标回收率**
正离子模式下，提取前和提取后加标AFFF样品分别剩余2.2%（62个峰）和2.1%（58个峰）的峰；负离子模式下分别为4.6%（36个）和3.6%（29个）。结果表明样品制备过程中正负离子模式峰无显著损失。

**3.1.7 地下水样品中AFFF加标回收率**
正离子模式下，提取前和提取后加标样品分别剩余0.92%（21个）和0.73%（16个）峰；负离子模式下分别为4.5%（31个）和3.5%（23个）。负离子模式检测较少，因为AFFF中阳离子和两性离子PFAS比例更高。提取前样品检测数多于提取后，可能由于基质效应。地下水基质效应在正离子模式中更显著，但经分析人员处理后，负离子模式基质效应较小。正离子模式未使用内标，可能影响结果。

**3.2 土壤提取方法比较**
**3.2.1 保留时间行为**
目标及疑似PFAS的保留时间(RT)与m/z呈非线性关系，拟合曲线覆盖m/z 200-900 amu，RT 1-35分钟。RT变异约束在±3分钟容忍范围内。但双质子酸(di-acids)和部分高m/z化合物落在容忍窗口外，若仅报告窗口内化合物将增加FN。

**3.2.2 EPA Method 1633土壤提取**
Method 1633在正离子模式下成功识别出56种SE方法未检测到的独特分析物，包括多种两性离子和阳离子疑似PFAS类（如N-HOEAmHOP-FASA、N-HOEAmP-FASAPS等）。负离子模式下，Method 1633识别出123种独特疑似PFAS，包括PFPeA、PFUnDA等靶标化合物以及多种新类（如1HO-n:2 FTS、PFAS Sulfinate等）。部分靶标PFAS仅被Method 1633检测到，原因可能在于支链异构体丰度差异。

**3.2.3 SE方法**
正离子模式下，SE方法仅检测到3种独特PFAS，其中一种为N-HOEAmP-FASE C8。负离子模式下，SE方法检测到3种独特分析物，仅PFHxSaAm为靶标PFAS。

**3.2.4 SE方法与Method 1633的比较**
正离子模式下，两种方法共同检测到1种靶标PFAS(6:2 FTAB)和50种疑似PFAS（如PFASaAm、N-TAmP-FASAP等）。负离子模式下，共同检测到85种疑似PFAS（如PFCAs、PFSAs等）。尽管Method 1633有约24倍浓缩因子，但WAX SPE树脂对两性离子和阳离子PFAS的保留能力（通过离子交换和疏水作用）是检测总数增加的主要原因。SE方法仅检测到极少数独特PFAS，因此研究人员认为当使用Method 1633时，无需额外穷尽提取。

**3.3 半定量**
**3.3.1 准确性**
采用绝对准确性商数(AAQ)评估准确性。正离子模式PFAS的AAQ为1.29±0.74，负离子模式为1.00±0.48。与文献中其他方法相比（如Cao等“全局校准曲线”AAQ为2.89，Pu等“专家选择替代物”AAQ为1.80），本研究方法展示了更高的准确性，归因于“专家选择替代物”与bootstrap方法结合。

**3.3.2 不确定性**
使用置信限倍数范围(CLFR)和置信商数(UCQ/LCQ)评估不确定性。正离子模式CLFR中位数为8.44±2.4E-06（范围窄，因可用标准品少），负离子模式中位数为1.96±4.36（范围1.7-26.8）。与文献相比，本研究CLFR值显著低于Pu等（A4:776, A5:1700），表明不确定性更低。UCQ和LCQ值：正离子模式LCQ 3.5±1.8，UCQ 2.4±1.7；负离子模式LCQ 1.5±175，UCQ 1.3±1.6。负离子模式UCQ接近1，表明上置信限过预测不严重，优于文献中其他方法。

**3.3.3 可靠性**
通过总体可靠性百分比(ORP)评估。正离子模式ORP为100%（因标准品少）。负离子模式ORP中位数为89%（范围56%-100%），与Pu等定量NTA方法的ORP相似。下可靠性百分比(LRP)中位数为100%，上可靠性百分比(URP)中位数为89%。

**讨论与结论**

本研究表明，经过验证的疑似筛查方法可生成可靠的高分辨率质谱数据，检测超出40种靶标PFAS分析物的前体物，辅助风险管理决策。提取前和提取后加标的水样本（纯水和地下水）均显示高PFAS回收率（82-94%），且重复样品间变异小。49种加标分析物中多数在低浓度和高浓度以及两种基质中一致检测，提取前后差异较小（约1%）。部分分析物被一致识别为FP（如PFHxSaAm和3:3 FTCA）或FN（如8:2 FTAcr），可能源于分析方法本身的局限性，而非提取效率问题。土壤验证中，EPA Method 1633在负离子和正离子模式下分别识别出123和56种独特PFAS，显著多于SE方法；两种方法共享一组核心PFAS（负离子85种，正离子50种）。Method 1633因24倍浓缩因子和WAX SPE树脂对两性离子/阳离子PFAS的保留能力，提供了更广的分析物覆盖范围。因此，当靶向大量PFAS化合物（阴离子、阳离子、两性离子）时，无需额外穷尽提取方法。本研究的疑似筛查方法优先采用保守的化合物识别和置信水平分配，而非庞大的疑似列表和自动库搜索。修改后的置信水平系统允许不同数据用户根据自身对FP和FN的容忍度进行过滤。保留时间过滤应谨慎使用，避免增加FN。采用“专家选择替代物”半定量方法展示了更高的准确性和可靠性，更低的 uncertainty，适用于疑似和NTA分析物的半定量。未来工作可更好地利用保留时间和候选质量数提高检测置信度，并优先添加可能在前次分析中观察到的疑似化合物。