《Journal of Neuroscience Methods》：Passive Nicotine Vapor Exposure Model in Mice Reveals Translationally Relevant Dose-Dependent Cotinine Levels and Withdrawal Behaviors
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被动尼古丁蒸汽在小鼠中剂量依赖性地提高血液可替宁(cotinine)水平；可替宁的性别差异仅出现在最高剂量50 mg/mL时；在15 mg/mL时，可替宁达到人类依赖阈值范围；两周的蒸汽暴露诱导小鼠出现躯体戒断体征；躯体依赖出现而无情感或生理体征。
被动尼古丁蒸汽在小鼠中剂量依赖性地提高血液可替宁(cotinine)水平；可替宁的性别差异仅出现在最高剂量50 mg/mL时；在15 mg/mL时，可替宁达到人类依赖阈值范围；两周的蒸汽暴露诱导小鼠出现躯体戒断体征；躯体依赖出现而无情感或生理体征。
烟草使用是美国可预防性死亡和疾病的主要原因，每年约48万人死亡，社会负担超3000亿美元。尽管尼古丁(nicotine)是主要精神活性成分，但电子尼古丁传送系统(Electronic Nicotine Delivery Systems, ENDS)的普及改变了成瘾格局，尤其在青少年和年轻成人中，电子烟使用率持续上升，导致快速形成高等级尼古丁依赖及潜在神经发育损害。为理解这种变化对大脑和身体的影响，需可靠动物模型模拟人类蒸汽暴露。然而，当前小鼠尼古丁蒸汽模型文献存在显著不一致和缺乏可重复性，例如开放场测试中分别报告蒸汽诱导的运动过多、过少或无效应，以及焦虑样行为的变异性；生理指标如体重和体温也无一致效应。这些差异主要源于方法学变异，尤其是缺乏对蒸汽浓度和生物学性别等关键因素的系统控制，以及未使用内部暴露生物标志物验证行为结果。尽管Frie等人在大鼠中纳入了这些设计要素，但小鼠中尚未实现。因此，研究人员开展本研究，将框架扩展至小鼠模型，旨在测试单次短时暴露是否产生与临床相关的血清可替宁(cotinine)水平，以及两周重复暴露是否足以诱导可测量的躯体戒断体征。研究涉及急性药代动力学队列和慢性行为队列，均包含两性。研究得出结论：被动蒸汽系统可产生剂量依赖性可替宁水平，最高剂量下雄性高于雌性；两周暴露可诱导躯体戒断体征，但无情感或生理体征。该模型高效、生物相关，为尼古丁依赖的高通量临床前研究提供了工具。论文发表在《Journal of Neuroscience Methods》。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：1) 定制被动蒸汽暴露系统：由四腔室组成，每腔室可同时暴露10只小鼠，通过空气压缩机、自动泵和solonoid阀控制，每2分钟输送90 mL蒸汽，1小时共30次抽吸，82%的腔室空气在两次抽吸间更新，确保离散暴露事件且位置无关；2) 血清可替宁酶联免疫吸附测定(ELISA)检测：急性暴露后20分钟经心脏穿刺采血，离心提取血清，使用Calbiotech试剂盒按说明书定量，样本稀释至标准曲线范围；3) 行为测试组合：包括旷场测试(open field test)评估运动活动和焦虑样行为（中央区域时间与边缘区域时间），躯体戒断体征评分（双盲独立评分爪震颤、身体震颤、抓挠、生殖器舔舐并求和），体温测量（直肠探针），以及尾浸试验(tail immersion test)评估痛觉敏感性（52°C水浴，记录尾退缩潜伏期，上限5秒）。样本队列来源：Cohort 1（药代动力学，N=69）为加利福尼亚大学圣地亚哥分校内部繁殖；Cohort 2（慢性行为，N=18）购自Jackson Laboratory。
研究结果：
3.1 血清可替宁水平在被动尼古丁蒸汽暴露后剂量依赖性增加：通过单次1小时暴露，使用0、5、15、50 mg/mL尼古丁溶液，血清可替宁水平呈剂量依赖性升高。两因素方差分析显示剂量效应显著（F(3,61)=49.75, p<0.0001），且剂量与性别交互作用显著（F(3,61)=3.82, p=0.014）。事后检验表明，仅在50 mg/mL浓度下存在显著性别差异，雄性的可替宁水平高于雌性。雌性中，Welch's ANOVA显示剂量效应显著（W(3,13.35)=71.71, p<0.0001），所有剂量间均存在显著差异；雄性中同样显示剂量效应显著（W(3,12.03)=23.24, p<0.0001），但0与5 mg/mL间无显著差异。该结果证明被动蒸汽系统在单次暴露后产生稳健的剂量依赖性血清可替宁升高，且最高浓度下出现性别差异。
3.2 两周被动尼古丁蒸汽诱导小鼠依赖体征：经过两周每天2小时暴露（分两次，间隔6小时）和24小时戒断，行为测试显示：尼古丁暴露组（5和15 mg/mL）总躯体戒断评分显著升高（单因素方差分析F(2,15)=21.02, p<0.0001），主要由爪震颤（F(2,15)=6.561, p=0.0090）和身体震颤（Welch's ANOVA W(2,8.18)=6.462, p=0.0207）驱动，而抓挠和生殖器舔舐无显著变化。旷场测试中，15 mg/mL组总运动距离显著增加（F(2,15)=7.182, p=0.0065），提示运动敏化；尽管中心区进入次数增加（F(2,15)=4.456, p=0.0303），但中心区停留时间无差异（F(2,15)=0.1189, p=0.8887），表明该增加源于多动而非焦虑减轻。尾浸试验中，15 mg/mL组尾退缩潜伏期显著延长（F(2,13)=5.442, p=0.0192），即痛阈升高（抗伤害感受）。体温在各组间无显著差异（F(2,15)=0.3832, p=0.6882）。焦虑样行为（中心区时间）无差异。这些结果表明两周被动蒸汽暴露足以诱导躯体依赖体征，以爪震颤和身体震颤为主，并伴随运动敏化和抗伤害感受，但无体温变化或焦虑样行为。
讨论部分：研究人员总结，本模型在单次1小时暴露中实现了覆盖人类依赖阈值（50-70 ng/mL）的血清可替宁水平，与轻度（<5支/天，65±10 ng/mL）和中等（<10支/天，215±30 ng/mL）吸烟者系统暴露相当。最高剂量下的性别差异（雄性高于雌性）与人类数据和临床前研究一致。与已发表小鼠蒸汽协议比较，本方案在更短时间内达到同等或更高可替宁水平，效率更高。两周间歇暴露诱导的躯体戒断体征（爪震颤和身体震颤）是可靠依赖指标，无需侵入性操作。旷场中的运动敏化表明间歇暴露优先激活敏化机制，而非连续输注模型中的耐受与依赖通路。缺乏焦虑样行为可能反映方法学限制（开放场灵敏度低于高架十字迷宫）或暴露时长不足。缺乏低体温和出现抗伤害感受（而非痛觉过敏）提示间歇蒸汽暴露产生不同于连续输注模型的神经生物学戒断特征，抗伤害感受可能源于戒断应激诱导的镇痛或测试方法差异（尾浸测试涉及脊髓反射 vs 热板测试涉及脊髓上通路）。局限性包括行为队列样本量（每性别3只）不足以检测性别差异，21次暴露可能不足以引发情感戒断，未使用美卡拉明(mecamylamine)诱发戒断，未监测体重和摄食。尽管如此，该被动蒸汽系统可产生人类相关药代动力学和躯体依赖，适用于高通量研究。
研究结论部分翻译：总之，本研究表征了一种在C57BL/6J小鼠中既时间高效又生物学相关的被动尼古丁蒸汽暴露模型。研究结果展示了血清可替宁(cotinine)水平一致且剂量依赖性的升高，准确反映了在单次1小时暴露中观察到的轻度和中度人类吸烟者的系统暴露。纳入两性揭示了药代动力学中的显著性别差异，在测试的最高浓度下雄性可替宁水平高于雌性，而行为队列不足以检测戒断结果中的性别差异。两周的间歇被动蒸汽暴露足以诱导躯体依赖，表现为显著的爪震颤和身体震颤，以及运动敏化持续至急性戒断期。躯体与生理戒断标志物的差异，特别是缺乏低体温和出现痛阈升高而非痛觉过敏，表明间歇蒸汽暴露产生与连续输注模型不同的神经生物学戒断特征，可能由敏化而非镇静机制驱动。尽管该模型用于捕捉情感戒断成分（如焦虑）的效用尚待证实，但这些结果支持该系统适用于尼古丁依赖的高通量临床前研究，并强调了在表征尼古丁戒断全谱时测定选择和暴露参数的重要性。
