生命早期铅暴露诱导的小鼠认知功能障碍中 Keap1/Nrf2 介导的铁死亡

《NeuroToxicology》：Keap1/Nrf2 mediated Ferroptosis in Early-Life Lead Exposure-induced Cognitive Dysfunction in Mice

　　

•早期铅暴露诱导小鼠神经元铁死亡及随后的长期认知障碍。
•铅暴露激活 Keap1 并抑制 Nrf2 抗氧化通路，导致海马中下游抗氧化和铁代谢相关蛋白失调。
•通过增加的脂质过氧化和降低的谷胱甘肽过氧化物酶活性验证了铅触发的铁死亡，并伴有神经元 APP 表达上调。
•Keap1/Nrf2 介导的铁死亡通路是铅诱导神经退行性病变和认知功能障碍的关键机制，为铅神经毒性治疗提供了新的治疗靶点。

引言
铅 (Pb) 是一种非必需重金属，无生理功能 (Sampson 等，2024)，具有熔点低和耐腐蚀性强的特点。铅存在于空气、水、土壤和沉积物中，土壤和沉积物是主要的汇。在矿床中，主要是方铅矿 (PbS) 存在于硫化物矿石中，常与锌、铜和银伴生；风化作用产生次生碳酸盐或硫酸盐。在城市土壤中，污染铅很少以游离 Pb2?形式存在；它吸附在铁/锰氧化物上或与腐殖酸结合。人为来源包括含铅油漆（碱式碳酸铅，Pb?O?）、陶瓷釉料 (PbO)、有色涂层玩具、某些化妆品和香料，以及来自铅管或焊料的饮用水。这些不同形式决定了其迁移性和暴露风险。
铅通过胃肠道和呼吸道进入人体后，发挥多系统毒性，其中神经系统是最敏感的目标。由于儿童的血脑屏障尚未完全成熟，他们对铅的神经敏感性明显高于成年人 (He 等，2022)。早期铅暴露可导致神经发育障碍，包括智力障碍、注意力缺陷和学习困难 (Lin 等，2019)。流行病学研究表明，低至 10 μg/dL 的血液铅浓度就会导致儿童智商的可测量下降 (Jusko 等，2008)；此外，儿童时期的慢性暴露会显著增加老年时患神经退行性疾病（如阿尔茨海默病 (AD)）的终身风险 (White 等，1993)。因此，阐明铅诱导神经毒性的分子机制并确定有效的预防或治疗靶点至关重要。尽管在某些地区铅暴露已大幅下降，但它仍然是一个普遍存在的全球健康问题。最近估计，全球约有 8 亿儿童的血液铅水平达到或超过 5 μg/dL，且负担不成比例地影响着中低收入国家的人群 (UNICEF, 2020)。这种持续的暴露强调了推进上述机制研究的迫切需要。
越来越多的证据表明，铅暴露加速了主要神经退行性疾病的发病和进展，如 AD、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症，其特征是脑和脊髓内神经元或髓鞘的不可逆丧失 (Chin-Chan 等，2019)。海马是负责记忆和空间导航的核心边缘结构，具有选择性脆弱性 (Lisman 等，2017)。成年期和发育期铅暴露均导致细胞结构解体、线粒体退化、突触异常和淀粉样前体蛋白表达升高，这导致啮齿动物出现认知、情感和运动缺陷 (Li 等，2021, Bihaqi 等，2014)。至关重要的是，进一步证据表明铅毒性模仿了神经退行性疾病的关键病理特征，尤其是阿尔茨海默病 (AD)。慢性铅暴露被证明通过上调淀粉样前体蛋白 (APP) 表达并损害其清除，加速了淀粉样蛋白β (Aβ) 肽的积累。此外，铅干扰激酶和磷酸酶活性，导致 Tau 蛋白过度磷酸化及随后的神经纤维缠结形成。这些分子改变通常伴有突触功能障碍，其特征是 PSD-95 和 SYN 等突触蛋白的下调，这与学习和记忆障碍直接相关 (Rahman 等，2012, G?ssowska 等，2016)。总之，这些发现表明铅诱导的神经毒性涉及类似于 AD 病理的复杂分子级联，超越了简单的氧化应激或细胞死亡。
铁死亡是一种铁依赖性的、非凋亡形式的调节性细胞死亡，其特征是脂质活性氧积累、亚铁离子超载、谷胱甘肽耗竭以及线粒体萎缩且外膜破裂。AD 大脑表现出区域性的铁升高，与认知下降相关，伴有脂质过氧化加剧（丙二醛和脂质 ROS 升高）和皮层谷胱甘肽减少 (Ayton 等，2020, Castellani 等，2009, Ansari 和 Scheff, 2010)；实验诱导的铁死亡加重了β-淀粉样蛋白介导的神经元丧失 (Bao 等，2021)。研究记录了帕金森病中可比较的病理变化，包括黑质铁沉积、谷胱甘肽耗竭和脂质过氧化 (Liu 等，2017, Bai 等，2021a)，肌萎缩侧索硬化症 (Wang 等，2023a) 和亨廷顿病。最近的人类和小鼠研究进一步表明，铅暴露改变了外周血和海马中铁死亡相关基因的表达（核因子 -E2 相关因子 2 (Nrf2)、溶质载体家族 7 成员 11 (SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4)），与认知障碍同时发生 (Cao 等，2024)。这些结果表明铅诱导的认知障碍与铁死亡密切相关。
Nrf2 是一种 Cap'n'collar (CNC) 家族转录因子，通过其 Neh2 DLG 和 ETGE 基序与 Keap1 的 Kelch 结构域结合而被保留在细胞质中，并由 Keap1–Cul3–E3 连接酶多聚泛素化以进行蛋白酶体降解。氧化或异源生物应激破坏这种铰链 - 锁扣复合物，使 Nrf2 核转位并转录上调抗氧化、抗炎、自噬和线粒体保护基因 (Kobayashi 等，2016, Wang 等，2023b)。在这些靶点中，Nrf2 诱导铁死亡守门人 GPX4 和 SLC7A11。SLC7A11 通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体系统 Xc? 驱动胱氨酸输入以合成谷胱甘肽 (GSH)。同时，GPX4 利用 GSH 将膜脂质氢过氧化物 (L-OOH) 还原为无害的醇 (L-OH)，从而维持脂质双层的完整性。GPX4 活性丧失、GSH 耗竭或系统 Xc? 抑制均导致脂质活性氧积累和神经元铁死亡 (Imai 等，2017)。从阿尔茨海默病患者获得的死后脑组织显示出 Nrf2–GPX4 通路的显著下降 (Dar 等，2024)。这种下降损害了脂质氢过氧化物的清除，并促进β-淀粉样蛋白沉积和黑质多巴胺能神经退化。该通路的药理学或遗传激活减少了 APP/PS1 转基因小鼠的β-淀粉样蛋白负荷和 Tau 磷酸化并改善认知，并延迟肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠的早期运动缺陷同时延长生存期 (Wang 等，2022)。值得注意的是，醋酸铅下调 C57BL/6 小鼠的海马 Nrf2 并损害认知，而 Nrf2 激活增加了海马谷胱甘肽合成，抑制氧化应激并挽救铅诱导的认知缺陷 (Liu 等，2020)。然而，Nrf2 介导的铁死亡是否促成铅神经毒性尚不确定。
为了调查这一点，我们建立了一个终生（或从妊娠到成年）饮用水铅暴露小鼠模型，使用 C57BL/6 后代并用地铅处理海马 HT-22 神经元细胞，以描绘 Nrf2–铁死亡轴在铅诱导神经发育损伤中的作用。我们的结果证明 Nrf2 介导的铁死亡是铅诱导神经发育损伤的关键驱动因素，提示了减轻重金属神经毒性的新治疗靶点，并为预防和治疗重金属诱导的神经退行性变提供了新证据。

部分片段
动物与实验设计
健康的成年无特定病原体 (SPF) C57BL/6 J 小鼠，包括 40 只雌性和 20 只雄性，体重 19 ± 1 g，购自广西医科大学实验动物中心 [SYXKG2025-0005]。小鼠饲养于标准条件下：温度 22–24°C，相对湿度 45 ± 10%，以及 12 h 光照 / 12 h 黑暗循环。所有实验方案和动物使用材料均经广西医科大学实验动物伦理委员会批准。

经过 7 天铅暴露导致新生儿小鼠神经功能障碍
在本研究中，使用 Morris 水迷宫测试来评估小鼠的空间记忆能力。结果显示，与对照组相比，高剂量组小鼠的逃避潜伏期显著延长，游泳距离从第 2 天到第 4 天增加，而各组游泳速度无显著差异。此外，在所有组中小鼠穿越原平台位置的次数显著减少

讨论
作为一种广泛的环境污染物，铅因其神经毒性风险引起了广泛关注。铅可在体内积累并诱导海马依赖性认知功能障碍 (Hauptman 等，2021)。新兴证据表明铅的神经毒性效应可能与铁死亡密切相关 (Zaidel 等，2013)。Nrf2 是调节氧化应激和维持细胞稳态的关键转录因子，在多种

结论
总之，早期铅暴露抑制 Keap1/Nrf2 通路，进而导致系统 Xc- 功能受损、GPX4 表达降低、细胞内铁稳态失衡以及脂质过氧化积累。这些变化最终触发海马神经元铁死亡，伴随神经退行相关蛋白表达异常和认知功能障碍。我们的研究表明，Nrf2 的药理学激活可以有效减轻

伦理声明
本研究中进行的所有动物程序均严格按照国际动物护理指南标准执行，并已获得广西医科大学动物护理与使用委员会批准（编号：SYXK 广西 2025-0005）。

CRediT 作者贡献声明
李绍军：写作 – 回顾与编辑，监督，资源。赵飞宇：写作 – 回顾与编辑，写作 – 原稿，调查。方圆圆：写作 – 回顾与编辑，监督，概念化。彭东杰：写作 – 回顾与编辑，监督，概念化。魏若昆：写作 – 原稿。乔凡：调查。黄黎明：写作 – 原稿，调查。杨彬彬：可视化，数据整理。李振宁：调查。戚子豪：

竞争利益声明
作者声明他们对这项工作没有利益冲突。我们声明我们没有任何代表与提交工作相关的利益冲突的商业或协会利益。

致谢
这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助 (资助项目号 82160626 和 81803281)，广西中青年骨干教师基础能力提升计划 (2025KY0125) 以及广西医科大学一流学科创新驱动人才计划。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

赵飞宇 | 黄黎明 | 杨彬彬 | 魏若昆 | 乔凡 | 戚子豪 | 李辉帅 | 李振宁 | 方圆圆 | 彭东杰 | 李绍军