细胞朊蛋白作为视网膜血管生成过程中血管丛稳定性的新型调节因子

《Neurochemical Research》：Cellular Prion Protein as a Novel Regulator of Vascular Plexus Stability During Retinal Angiogenesis

　　

血管生成不仅在胚胎发生过程中至关重要，在成体生理和疾病中也同样重要，其依赖于血管内皮生长因子（VEGF）梯度引导顶端细胞出芽。细胞朊蛋白（PrPC）在多种神经血管单元（NVU）细胞类型中表达，通过层粘连蛋白结合调节神经元和星形胶质细胞分化，但其在血管生成中的作用仍未得到充分研究。本研究探讨了其在视网膜血管发育中的功能。在PrPC基因敲除小鼠中，浅层视网膜血管丛表现出顶端细胞密度和分支增加，伴随小胶质细胞形态功能改变和Vegf-c表达减少，这些特征与血管稳定性受损一致。来自PrPC基因敲除小胶质细胞的条件培养基足以在体外增加内皮细胞不稳定性，表明改变的小胶质细胞信号传导可调节血管表型。此外，层粘连蛋白411/511亚型和IV型胶原在视网膜血管基底膜中表达减少，支持基底膜组成改变。在后期发育阶段，PrPC缺失导致向更深视网膜层的垂直出芽增加，导致深层血管丛短暂性血管过度形成以及所有血管层中层粘连蛋白沉积缺陷。这些变化伴随ZO-1分布改变和视网膜层组织紊乱，表现为血管丛间距离减少。总体而言，研究结果确定PrPC是发育中视网膜出芽性血管生成和血管稳定化的调节因子。数据支持一个模型，其中PrPC通过小胶质细胞依赖性和内皮细胞内在机制调节神经血管相互作用，尽管这些成分的相对贡献仍有待确定。

**论文解读：细胞朊蛋白通过调控神经血管相互作用调节发育期视网膜血管生成与稳定性**

**一、研究背景与问题提出**

血管生成是中枢神经系统（CNS）血管网络扩张和成熟的主要机制，其过程受到内皮细胞、神经谱系细胞和驻留小胶质细胞之间协调互作的精密调控。在CNS中，神经环境通过血管内皮生长因子（VEGF）梯度引导顶端细胞出芽，同时相邻的柄细胞增殖以延伸血管，形成尖端-柄细胞平衡，这一平衡由VEGF-Notch信号通路调控。小鼠视网膜因其发育过程可及且具有固定模式，是研究CNS血管生成的理想模型。视网膜血管发育遵循明确的时空顺序：出生时视网膜基本无血管，星形胶质细胞从视神经头迁移并建立模板，内皮细胞随后出芽形成浅层血管丛；垂直 sprouts 随后伸入实质，按序形成深层和中间血管丛，最终通过修剪和重塑优化网络。

细胞朊蛋白（PrPC）在人类CNS中高表达，定位于富含胆固醇和鞘磷脂的脂筏结构域，参与多种分子的运输和信号转导。尽管PrPC在朊病毒病中已被充分研究，但其生理功能尚未完全阐明。已知PrPC通过其配体（如应激诱导蛋白1（STI1）和层粘连蛋白）调节神经元的存活和分化，并在星形胶质细胞中发挥重要作用。此外，PrPC在人和小鼠内皮细胞中均有表达，且PrPC缺失可降低脑微血管内皮细胞中Occludin和Claudin-5的水平，导致血管通透性增加，提示PrPC对内皮单层完整性至关重要。然而，PrPC及其配体在内皮细胞中，尤其是在CNS发育期间血管生成调控中的作用，仍缺乏直接证据。

**二、研究内容与主要结论**

为探究PrPC在小胶质细胞-血管串扰中的作用，研究人员利用PrPC基因敲除小鼠（Prnp^0/0）及其野生型对照（Prnp^+/+），系统分析了出生后不同时间点（P0-P21）的视网膜血管发育过程。研究发现，PrPC缺失导致浅层视网膜血管丛顶端细胞密度增加约44%，血管密度增加三倍，分支点增加18%，同时Vegf-a mRNA表达上调。基底膜成分分析显示，Prnp^0/0视网膜中IV型胶原（Col4α1）和层粘连蛋白α4、α5链（Laminin-411和Laminin-511）的mRNA水平均降低约50%，免疫荧光也证实相应蛋白沉积减少。在血管前沿，Prnp^0/0视网膜的小胶质细胞密度增加64%，并表现出形态学改变：细胞面积减小、分支减少、周长缩短、圆形度增加，提示小胶质细胞处于反应性/未成熟表型。基因表达分析显示，Prnp^0/0视网膜中Vegf-c mRNA水平显著降低，而Cx3cr1、Il1β、Arg1和Il4表达升高。体外实验表明，来自Prnp^0/0小胶质细胞的条件培养基能显著增加人脑微血管内皮细胞（HBMECs）的管形成分支数，但降低总网络面积，并在48小时后导致更明显的血管回缩，表明内皮网络不稳定性增加。划痕实验显示，Prnp^0/0小胶质细胞条件培养基使内皮细胞迁移能力提高75.2%。在发育时间进程上，Prnp^0/0视网膜的血管重塑阶段从P5-P9延迟至P9-P12，且垂直 sprouts 数量在P9增加62%，深层血管丛在P9和P12呈现过度血管化。在P12，Prnp^0/0视网膜中所有三层血管丛的层粘连蛋白沉积均减少，ZO-1分布出现不连续性，且血管丛间距离减少67%，视网膜总厚度显著降低。这些结果表明，PrPC是发育期视网膜血管生成和稳定的关键调节因子，其缺失导致过度但失稳的出芽、基底膜组成改变和小胶质细胞功能异常。

**三、主要关键技术方法**

研究人员使用了多种实验技术：①基因敲除小鼠模型（Prnp^0/0，C57BL/6J背景）；②视网膜整体mount免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像，用于分析血管形态、顶端细胞、小胶质细胞形态和基底膜蛋白；③定量PCR（qPCR）检测基因表达；④原代小胶质细胞培养及条件培养基制备；⑤人脑微血管内皮细胞（HBMECs）Matrigel管形成实验和划痕迁移实验；⑥3D共聚焦重建和形态计量分析（ImageJ、AngioTool）。

**四、研究结果分述**

**1. Prnp^0/0血管丛在视网膜发育期间表现出增加的出芽和分支**

通过免疫荧光和定量分析，在P5时Prnp^0/0视网膜的顶端细胞数量增加约44%，Vegf-a mRNA上调，血管密度增加三倍，分支点增加18%。Collagen IV染色显示，虽然绝对空鞘数量增加，但归一化至血管面积后差异不显著，表明血管回归事件未明显增多。

**2. Prnp^0/0视网膜中Collagen-IV和Laminin表达水平降低**

双免疫荧光和qPCR显示，Prnp^0/0视网膜中Col4α1、Lama411和Lama511的mRNA水平均降低约50%，免疫荧光也证实蛋白沉积减少，表明基底膜组成改变。

**3. P5 Prnp^0/0视网膜血管前沿小胶质细胞密度增加并伴随形态功能改变**

IBA-1染色显示小胶质细胞密度增加64%，形态学分析显示细胞面积减小、分支减少、周长缩短、圆形度增加，呈现未成熟/反应性表型。qPCR显示Vegf-c降低，Cx3cr1、Il1β、Arg1和Il4升高。

**4. Prnp^0/0小胶质细胞条件培养基处理的内皮管状网络在体外表现出增加的不稳定性和迁移**

Matrigel管形成实验表明，Prnp^0/0小胶质细胞条件培养基增加分支点但降低总网络面积，48小时后血管回缩更明显。划痕实验显示迁移能力增加75.2%。

**5. Prnp^0/0视网膜中浅层血管丛的扩展和重塑发生改变**

在不同发育时间点（P3、P5、P9、P12、P21）分析分支点，发现Prnp^0/0视网膜在P5、P9和P12分支点增加，而重塑阶段从P5-P9延迟至P9-P12，但P21时恢复正常。

**6. Prnp^0/0视网膜在深层血管丛形成期间表现出增加的垂直 sprouts 密度和血管化**

3D重建显示P9时垂直 sprouts 数量增加62%，Dll1表达降低。深层血管丛在P9和P12分支点增加，但P21时差异消失。

**7. Prnp^0/0视网膜中所有三个血管丛的Laminin沉积减少，ZO-1分布改变**

在P12视网膜切片中，定量分析显示层粘连蛋白荧光强度（归一化至IB4+血管面积）显著降低。ZO-1染色在Prnp^0/0血管中呈不连续分布，提示内皮连接组织受损。

**8. Prnp^0/0视网膜血管丛组织改变伴随神经视网膜结构重塑**

3D投影显示血管丛间距离减少67%，神经视网膜层（GCL、INL、ONL）显著变薄和致密化，总视网膜厚度降低。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，PrPC通过调节小胶质细胞分泌的因子（如VEGF-C）和内皮细胞内在机制影响血管生成。虽然小胶质细胞条件培养基能改变内皮行为，但整体基因敲除模型无法区分细胞类型特异性贡献。基底膜中层粘连蛋白和IV型胶原的减少可能直接或间接导致血管不稳定，而Dll1表达的降低可能促进垂直 sprouts 形成。ZO-1分布异常提示血-视网膜屏障可能受损。神经视网膜层变薄和层间距减少表明PrPC对神经血管整体结构至关重要。研究结论为：PrPC是发育期视网膜出芽性血管生成和血管稳定化的调节因子，通过小胶质细胞依赖性和内皮细胞内在机制调节神经血管相互作用。该研究为理解PrPC在CNS血管发育中的生理功能提供了新见解，并可能为缺血性视网膜病变等病理情况提供潜在治疗靶点。