《Toxicological Research》：Current and emerging new approach & methodologies for skin hazard assessment
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兔Draize试验和豚鼠最大化试验等动物试验数十年来一直作为评估皮肤危害的标准试验，但由于与人类反应的一致性差和伦理问题而面临局限性。最近，全球监管转变（如FDA现代化法案3.0）正在加速向非动物新途径方法学(NAMs)的范式转变。因此，建立能够精确模拟人类生
兔Draize试验和豚鼠最大化试验等动物试验数十年来一直作为评估皮肤危害的标准试验，但由于与人类反应的一致性差和伦理问题而面临局限性。最近，全球监管转变（如FDA现代化法案3.0）正在加速向非动物新途径方法学(NAMs)的范式转变。因此，建立能够精确模拟人类生理环境的新型测试平台，超越简单的二维人类细胞模型和标准化三维重建人类表皮(RhE)，已成为一项重要挑战。本综述总结了当前用于评估皮肤刺激/腐蚀、致敏和光毒性的标准非动物试验方法，并按主要皮肤危害终点对新技术趋势——类器官、皮肤芯片和计算机模拟——进行了全面系统的分类。此外，研究人员分析了这些技术在监管接受方面的机遇与挑战，旨在为未来皮肤危害评估的方向提供见解。
引言
历史上，皮肤危害评估严重依赖传统动物实验，如兔Draize试验（OECD TG 404）或豚鼠最大化试验（GPMT，OECD TG 406）。然而，这些方法因种间皮肤结构和敏感性差异导致与人类反应相关性低而持续受到批评。随着2013年欧盟全面禁止化妆品动物试验，动物数据不再被接受为安全性证实的伦理或法律标准。因此，在3R原则（替代、减少、优化）中，不使用动物的替代技术——新途径方法学(NAMs)备受关注。皮肤危害并非单一终点过程，评估策略因而因评估的具体终点而异。主要皮肤危害终点包括：皮肤刺激/腐蚀（涉及直接皮肤组织损伤）、皮肤致敏（涉及免疫系统）和光毒性（暴露于紫外线和光毒性化学物质时发生）。重建人类表皮(RhE)模型、合成肽（DPRA）、人工膜基试验（Corrositex?）以及THP-1（h-CLAT）、HaCaT（KeratinoSens?）或3T3（NRU试验）等细胞系已在OECD、ISO和FDA等不同监管环境中被采用。然而，当前标准NAMs仍面临明显技术差距：传统模型在评估混合物和配方时存在局限性，且假阳性率高；皮肤致敏试验中，在反映代谢激活过程（前/预半抗原）或复杂免疫微环境方面存在不足；大多数系统仍处于静态环境，难以模拟血液或淋巴流及复杂皮肤结构等动态细胞间或细胞-组织相互作用。由于没有任何单一NAM能完全捕获皮肤危害生物学的所有相关维度，需要整合策略将化学反活性、屏障破坏、免疫激活、组织水平动力学、暴露相关性和计算优先级等证据结合起来。因此，本综述分析现有NAMs的局限性，并探讨下一代技术——如皮肤芯片、皮肤类器官和人工智能应用——作为可整合到整合测试与评估策略(IATA)、确定方法(Defined Approaches)和NGRA中的补充证据流，而非孤立替代方案。
当前皮肤刺激和腐蚀测试方法现状
体外评估策略
当前皮肤刺激和腐蚀的体外方法主要通过模拟活体表皮损伤或屏障破坏来支持无动物危害分类。然而，每种方法捕获刺激/腐蚀生物学的不同方面，其监管用途取决于检测读数与预期决策背景是否匹配。
重建人类上皮模型（RhE模型，OECD TG 431、439）：RhE模型通过在气液界面(ALI)培养人类角质形成细胞来重现皮肤的多层结构。原理是通过MTT法测定细胞活力，若低于50%则判定物质为刺激物。EpiSkin?、EpiDerm?和韩国开发的KeraSkin?等模型被列入OECD指南。基于比传统Draize试验更高的灵敏度（约98%）和准确性，它们被用作化妆品（OECD TG 431、439）和医疗器械（ISO 10993-23）安全评估的全球标准。然而，尽管RhE模型解决了动物试验的种属相关性问题，但仍受限于静态培养条件、单一终点活力读数和缺乏屏障破坏或组织恢复实时监测。
跨上皮电阻(TER)方法（OECD TG 430）：TER方法利用切除的大鼠皮肤活检测量化学暴露后电阻变化。若电阻降至5 kΩ·cm2以下，表明皮肤屏障破坏，则判定为腐蚀性。虽然由于高灵敏度（88-94%）和可重复性，作为腐蚀物的初级筛选工具有用，但基本局限性包括使用大鼠组织导致的种属差异和无法完全替代动物。因此，TER有助于识别屏障破坏性腐蚀物，但对刺激机制、人类特异性反应或更广泛的GHS亚分类信息较少。对于表面活性剂或极端pH化合物也可能出现错误结果。
膜屏障试验（Corrositex?，OECD TG 435）：膜屏障试验测量化学物质穿透生物屏障（模拟角质蛋白层的蛋白质凝胶）的突破时间，以精确确定UN GHS腐蚀类别（1A、1B、1C）。由于高准确性（约96%）和一致性，它适用于高腐蚀性物质的早期筛选。Corrositex?无需活体组织即可进行快速腐蚀分类，但其人工屏障设计限制了生物学解释，并可能降低对具有挑战性pH、颜色或基质特性的化学物质的适用性。
离体方法
真皮吸收评估（OECD TG 428）：基于OECD TG 428的离体皮肤模型通过将人或猪皮肤组织安装在Franz扩散池中，评估定量经皮吸收和渗透性。通过TEWL或TER验证屏障完整性是测试有效性的关键指标。尽管存在供体变异等局限性，该模型因维持皮肤组织结构并反映实际生理特征，被ISO和美国EPA广泛认可为吸收评估标准。因此，真皮吸收评估提供与暴露相关的渗透性信息，这是刺激/腐蚀试验无法捕获的，尽管它并非设计用于直接分类局部组织损伤。
综上，这些方法应被视为互补工具而非彼此的直接替代品，因为它们在皮肤危害评估中解决不同的生物学和监管问题。重建人类表皮(RhE)模型代表了基于屏障的皮肤刺激和腐蚀试验的人类相关标准化平台；TER和Corrositex?对快速腐蚀筛选有效，但TER受限于切除大鼠皮肤的使用，而Corrositex?的适用性受化学物质性质和潜在检测干扰限制；相反，真皮吸收试验并非设计用于分类刺激或腐蚀，而是量化经皮渗透和屏障功能，使其成为与暴露相关的平行终点而非竞争性替代。因此，当前OECD一致的方法构成了一个分层工具箱，每个平台提供不同的信息层，其联合使用比依赖单一试验为皮肤危害评估提供更具信息量的基础。
皮肤刺激和腐蚀测试的新兴技术
微生理系统
皮肤芯片(SoC)平台：皮肤芯片（图1）是下一代微生理系统，通过整合微流体技术克服现有RhE模型的静态培养限制。SoC通过泵或倾斜装置连续循环培养基，模拟体内灌注环境，优化营养/氧气供应和废物清除，从而提高真实组织相似性和长期活力。特别是，血管样结构、免疫细胞成分和内置传感器的整合，能够控制监测屏障完整性、炎性细胞因子以及TEER和pH等理化参数。因此，SoC在单一微生理平台内整合了灌注、多细胞组织和无损读数的功能。与传统的RhE系统相比，SoC平台通过将灌注、血管室和某些设计中的免疫细胞成分结合起来，将皮肤建模从静态上皮屏障扩展到动态微生理环境。这允许评估屏障破坏、组织恢复、炎症反应以及超越基于终点活力读数的细胞间串扰。然而，这些优势伴随着设备复杂性、通量有限、芯片间变异性以及需要更广泛的监管验证等局限性。因此，SoC平台不应被解释为RhE模型的直接替代品，而是先进的补充系统。在这个意义上，SoC平台解决了传统RhE模型无法完全概括的皮肤刺激/腐蚀反应的动力学、多细胞和环境方面。
计算机模拟预测方法
基于理化性质的机器学习模型（XGBoost）：Kang等人（2023）使用545种液体化学物质的体内Draize数据构建了基于XGBoost的皮肤刺激和腐蚀分类模型。通过分析34个理化描述符，选择22个关键变量（如LogP、PSA、氧原子数、熔点）构建三元和二元分类器。该模型表现出优于基于规则模型的性能（二元准确性：0.81，敏感性：0.92）。SHAP分析确定亲脂性和PSA是主要决定因素，增强了模型透明度。
基于循环神经网络的深度学习模型（BiLSTM/LSTM）：Duy等人（2025）开发了高性能BiLSTM/LSTM深度学习模型，使用SMILES/MACCS密钥和理化描述符的联合特征对GHS皮肤腐蚀/刺激进行分类。BiLSTM模型整合了亚结构信息和理化特征，显示出优于仅使用序列信息模型的性能（刺激准确性：85.7%，特异性：100%）。
可解释人工智能(XAI)模型（AttentiveSkin）：Huang等人（2024）开发了AttentiveSkin，这是一种基于Attentive FP算法（GNN家族）的XAI模型，使用包含3000多种化合物的GHS共识数据集。它实现了高可靠性（腐蚀AUC：97.1%），并通过注意力权重可视化确保了可解释性，允许定量识别毒性基团。
在计算机模拟方法中，XGBoost模型利用理化描述符提供强大的预测性能和相对透明的特征重要性，适合作为可解释的基线筛选。相比之下，BiLSTM/LSTM模型从SMILES和指纹特征中捕获序列和亚结构水平信息，可能提高化学多样性数据集的分类性能，但高度依赖训练数据质量和适用性领域。AttentiveSkin通过基于注意力的学习可视化毒性基团和结构警报，进一步增强了可解释性，从而支持机制解释和优先级排序，尽管基于注意力的信号不应被解释为明确的因果毒理学机制。然而，这些模型仍受限于数据集大小、类别平衡、适用性领域和外部验证要求。因此，计算机模拟方法最适合作为筛选、优先级排序和假设生成的计算证据流，而不是经验验证试验的独立替代品。实际上，它们的最大价值在于支持整合测试策略，将计算预测与体外证据相结合，以实现更高效和机制知情的皮肤危害评估。
总体而言，这些SoC平台和计算机模拟模型将皮肤刺激/腐蚀评估从静态危害分类扩展到动态监测、机制解释和快速优先级排序。然而，它们的常规监管使用将需要更强的验证、标准化性能标准以及与现有OECD一致试验的更清晰整合。
当前皮肤致敏测试方法现状
图2说明了皮肤致敏的AOP框架，并为将当前NAMs映射到特定关键事件提供了基础。皮肤致敏涉及复杂的免疫反应；因此，基于不良结局通路(AOP)（图2）的非动物方法已成为标准，取代了小鼠局部淋巴结试验(LLNA)和GPMT。OECD AOP定义了四个关键事件(KE)：分子起始事件（蛋白质结合，KE1）、角质形成细胞激活（KE2）、树突状细胞激活（KE3）和T细胞激活/增殖（KE4）。当前非动物试验方法通常针对单一KE而非整个致敏过程。化学方法如DPRA主要针对KE1，ARE-Nrf2荧光素酶试验如KeratinoSens?针对KE2，细胞试验如h-CLAT、U-SENS和GARDskin针对KE3。相比之下，KE4和连接树突状细胞激活与抗原特异性T细胞反应的下游过程仍较少被标准OECD接受的NAMs直接覆盖。表1将代表性试验和平台映射到相应的关键事件、证据类型和剩余局限性。
这种映射表明，当前NAMs在皮肤致敏AOP中提供互补但不完整的证据。因此，单个试验不应被解释为动物试验的独立替代品，而应作为需要在基于AOP的IATA、确定方法和NGRA内整合的证据流。KE4有限的直接覆盖也解释了人们对免疫 competent 3D皮肤模型和皮肤芯片系统日益增长的兴趣，旨在弥合单一KE试验和整合免疫反应之间的差距。
化学方法
直接肽反应性试验（DPRA，TG 442C）：通过HPLC定量半胱氨酸和赖氨酸肽的消耗来评估蛋白质结合（KE1）。类似方法如ADRA和kDPRA已被开发以改进DPRA的干扰和强致敏物区分。虽然可重复，但DPRA缺乏代谢激活系统，使得前半抗原检测困难。更重要的是，对于前半抗原、氧化依赖性致敏物、难溶物质以及半胱氨酸/赖氨酸反应性域外的化学物质，其性能可能降低，试验结果也可能受肽溶解度、共洗脱或其他分析干扰影响。因此，DPRA应被视为KE1/MIE的稳健第一层试验，但不是完整致敏反应的独立预测因子。
与DPRA并行，已引入几种更新的化学方法以拓宽KE1覆盖的化学适用性领域并改善实际操作性能。谷胱甘肽(GSH)基试验用生物相关的内源性硫醇亲核试剂替代合成肽，通常采用荧光或分光光度检测，提供更简单且通常更经济的格式，同时保持对亲电反应性的相同机制关注。N-乙酰-L-半胱氨酸甲酯(NACME)基试验遵循类似逻辑，但旨在提高光学读数稳健性并减少干扰，近期研究报道了对皮肤致敏潜力的有用筛选性能。ProtReact是一种较新的高通量光学读数试验，被提议用于皮肤致敏危害评估，其预测能力与DPRA相当，但在敏感性和特异性方面表现出试验特异性权衡。DCYA基方法也被开发为KE1测量的替代化学方法，而NBT基方法已被探索为额外的反应性试验。与DPRA相比，这些试验主要在亲核试剂选择、检测化学、通量和干扰易感性方面不同，但它们仍以第一关键事件的化学反应性为中心。因此，它们应被解释为可加强证据权重评估的补充KE1工具，而不是细胞试验或多终点整合测试策略的替代品。
计算机模拟方法
（OECD）QSAR Toolbox和DEREK Nexus：这些工具利用结构-活性关系、交叉参照和基于知识的专家系统来预测致敏危害并检测结构警报。它们被广泛用于整合测试策略(IATA)中以填补数据空白，作为OECD TG 497确定方法的一部分，并提供证据权重(WoE)。这些计算机模拟方法对于在IATA或确定方法中填补数据空白和支持交叉参照特别有用；然而，其可靠性取决于参考数据的质量、结构相似性假设、适用性领域和专家解释。因此，它们最好用作支持性证据流，而非实验性NAMs的独立替代品。
体外二维细胞试验
ARE-Nrf2荧光素酶试验（KeratinoSens?，TG 442D）：通过Nrf2-ARE通路报告基因评估角质形成细胞激活（KE2）。人类细胞系激活试验（h-CLAT，TG 442E）：通过测量THP-1细胞上CD54和CD86表达评估树突状细胞激活（KE3）。人类髓系细胞系U937皮肤致敏试验（U-SENS，TG 442E）：通过测量表面标志物CD86上调评估树突状细胞激活（KE3）。基因组过敏原快速检测（GARDskin，TG 442E）：利用SVM算法分析人类来源树突状细胞(SenzaCells)中196个基因（基因组特征）的表达模式。它克服了单一标志物试验的局限性，获得了高准确性（94%），甚至对亲脂性化合物和金属等难测物质也有效。
这些二维细胞试验为KE2和KE3提供了机制证据，补充了针对KE1的化学方法。然而，由于它们依赖简化的细胞系统，不能完全重现组织水平的免疫串扰、抗原呈递、细胞迁移或抗原特异性T细胞激活。这一局限性进一步支持了跨KE1-KE3试验整合解释和针对KE4相关反应的新型平台的必要性。
总之，当前皮肤致敏NAMs提供了机制结构化但不完整的AOP覆盖。DPRA和相关化学方法针对KE1，KeratinoSens?针对KE2，h-CLAT、U-SENS和GARDskin针对KE3，而KE4仍未被标准化直接试验充分代表。因此，主要机遇在于将这些部分证据流结合到IATA、确定方法和NGRA中，而主要挑战仍是代谢激活、组织水平免疫相互作用、效力估计和下游T细胞反应的整合。
皮肤致敏测试的新兴技术
KE4和多步骤免疫反应的有限覆盖支持了对下一代平台的需求，这些平台提供超越单一KE试验的证据。先进的3D模型、微生理系统和基于AI的整合方法并非旨在取代单个OECD试验，而是可提供关于免疫细胞相互作用、组织水平反应、下游适应性免疫激活和效力预测的额外证据。
