《Journal of NeuroVirology》：SARS-CoV-2 disrupts the integrity of a human blood-brain barrier model in the absence of infection
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在COVID-19患者中可观察到神经系统症状，包括嗅觉丧失、味觉丧失、认知障碍以及更严重的并发症，包括脑炎和缺血性中风。此外，包括“脑雾”在内的持续性认知障碍被认为是长新冠综合征的一部分。尽管已证明SARS-CoV-2能在体外和体内感染中枢神经系统（CNS）的
在COVID-19患者中可观察到神经系统症状，包括嗅觉丧失、味觉丧失、认知障碍以及更严重的并发症，包括脑炎和缺血性中风。此外，包括“脑雾”在内的持续性认知障碍被认为是长新冠综合征的一部分。尽管已证明SARS-CoV-2能在体外和体内感染中枢神经系统（CNS）的细胞，但目前尚不清楚CNS的直接感染，还是包括凝血级联反应激活或免疫激活在内的间接机制，是COVID-19神经病理学的主要驱动因素。研究人员调查了灭活的SARS-CoV-2或刺突蛋白是否会在无感染的情况下破坏血脑屏障（BBB）的完整性，并表征了神经炎症。使用由原代人微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和小胶质细胞组成的体外BBB模型，研究人员观察到该模型暴露于SARS-CoV-2或刺突蛋白后出现了BBB破坏。重要的是，在腔内侧（模拟“血液侧”）或腔外侧（“脑侧”）暴露于灭活病毒或刺突蛋白后，均观察到BBB完整性的丧失。此外，在腔内侧或腔外侧暴露于SARS-CoV-2或刺突蛋白后，还观察到一系列趋化因子、炎症细胞因子和黏附因子的转录上调，以及BBB模型释放炎症细胞因子。这些数据表明，体外BBB破坏和免疫激活是在无感染的情况下对SARS-CoV-2作出的反应发生的，这凸显了在SARS-CoV-2感染期间宿主免疫系统在BBB破坏中的重要性。
【研究背景与意义】
COVID-19患者常伴有神经系统症状，包括嗅觉丧失、味觉丧失、认知障碍以及更严重的并发症如脑炎和缺血性中风。此外，包括“脑雾”在内的持续性认知障碍被认为是长新冠综合征的一部分。虽然已有研究表明SARS-CoV-2能在体外和体内感染中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的细胞，但目前尚不完全清楚是CNS的直接感染，还是包括凝血级联反应激活或免疫激活在内的间接机制，才是驱动COVID-19神经病理学的关键因素。血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）是神经血管单元的组成部分，作为血液与大脑的界面，介导CNS与外周的交流，并限制病原体进入脑实质。然而，目前关于SARS-CoV-2与BBB之间的相互作用仍有许多未解之谜，例如SARS-CoV-2直接感染BBB的能力、病毒感染对BBB完整性的影响、病毒跨越BBB的机制以及炎症反应在BBB破坏中的作用。为此，研究人员开展了相关研究，调查在没有病毒感染的情况下，灭活的SARS-CoV-2或刺突蛋白是否会破坏BBB的完整性并引发神经炎症。研究得出结论，在没有直接病毒感染的情况下，BBB的破坏和免疫激活依然可以发生，这凸显了在SARS-CoV-2感染期间宿主免疫系统在BBB破坏中的关键作用。这一发现对于理解COVID-19相关的神经系统并发症的发生机制具有重要意义，该研究发表在《Journal of NeuroVirology》上。
【关键技术方法】
研究人员利用由原代人脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells, BMEC）、星形胶质细胞、周细胞和小胶质细胞组成的体外BBB模型开展研究。通过在Transwell小室中建立四重共培养系统来模拟复杂的BBB结构，并采用热灭活的SARS-CoV-2或重组刺突蛋白从腔内侧（luminal，模拟“血液侧”）或腔外侧（abluminal，“脑侧”）处理模型。研究主要使用了跨内皮电阻（Transendothelial Electrical Resistance, TEER）测量和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran 40 kDa, FD40）通透性测定来评估BBB的完整性。此外，结合定量PCR、蛋白质印迹法、RT
2 Profiler PCR Array以及酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，从转录和蛋白水平全面表征了神经炎症反应及紧密连接蛋白的变化。
【研究结果】
SARS-CoV-2 and recombinant spike protein compromise BBB integrity
通过TEER测量和FD40通透性测定发现，接种热灭活的SARS-CoV-2或SARS-CoV-2刺突蛋白会导致TEER值以剂量和时间依赖的方式降低，并增加BBB对FD40的通透性。特别是在接种5 μg刺突蛋白72小时后，TEER值从接种时的50 Ω.cm2显著下降至26.5 Ω.cm2。这表明在不存在病毒复制的情况下，SARS-CoV-2及其刺突蛋白均可破坏BBB的完整性。
SARS-CoV-2 spike protein reduces BMEC tight junction protein expression
通过qPCR和蛋白质印迹法检测发现，刺突蛋白处理以浓度和时间依赖的方式降低了BMEC中紧密连接蛋白的转录水平和蛋白表达水平。其中claudin-5和ZO-1的mRNA水平下降最为显著，在腔内侧给予5 μg刺突蛋白处理72小时后，基因表达降幅超过50%；occludin、VE-cadherin和JAM-1的表达也有不同程度的下调。在腔内侧给药时，紧密连接蛋白表达的下降比腔外侧更为显著。
Inoculation with SARS-CoV-2 induces transcriptional upregulation of inflammatory cytokines, proteinases, and adhesion molecules in cells of the BBB
通过RT
2 Profiler PCR Array分析发现，无论从腔内侧还是腔外侧接种SARS-CoV-2，BMEC、小胶质细胞、星形胶质细胞和周细胞均表现出强烈的促炎反应。趋化因子（如CXCL10、CCL5、CCL2）、促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）、转录因子NF-kB、炎症小体蛋白NLRP3和NLRC3、黏附分子ICAM-1以及基质金属蛋白酶MMP-9的基因表达显著上调，而血管生成相关基因ANGP-1表达下调。腔内侧接种引起了更大程度的炎症免疫反应相关基因表达增加。
Inoculation with SARS-CoV-2 or spike protein stimulates a pro-inflammatory response in the BBB in vitro
通过ELISA检测细胞培养上清液发现，腔内侧或腔外侧接种SARS-CoV-2或刺突蛋白后，BBB模型释放的趋化因子MCP-1和IP-10以及促炎细胞因子IL-1β显著增加。腔内侧接种时，这些因子主要释放至腔内侧；而腔外侧接种SARS-CoV-2时，则主要释放至腔外侧，并引起IFN-α在腔内侧的显著增加。这表明病毒或刺突蛋白在无感染情况下即可触发急性的促炎反应并导致BBB破坏。
【讨论部分总结与研究结论翻译】
在讨论部分，研究人员指出，该研究使用由原代人脑细胞组成的多种细胞模型，进一步证实了SARS-CoV-2及其刺突蛋白对BBB完整性的破坏作用。研究首次报告了从腔外侧（“脑侧”）暴露于灭活的SARS-CoV-2同样会破坏BBB的完整性，这表明无论病毒通过何种途径进入CNS，其存在都会影响BBB的完整性。尽管缺乏有效感染，SARS-CoV-2或刺突蛋白依然降低了紧密连接蛋白的表达，提示可能发生细胞旁转运。此外，研究证明了暴露于SARS-CoV-2会促进内皮细胞激活和超炎症反应，促炎细胞因子和黏附分子的释放可能促进了白细胞进入CNS，从而加剧神经炎症，这可能与急性和急性后期COVID-19患者中观察到的CNS障碍有关。研究的局限性在于体外使用的刺突蛋白浓度可能高于体内循环水平，但与CNS内可能持续检测到的水平一致。
研究结论翻译如下：
本研究表明，在无BBB形成细胞病毒感染的情况下，SARS-CoV-2破坏了人体外BBB模型的完整性。SARS-CoV-2神经炎症可能源于在无感染情况下BBB暴露于病毒蛋白，这可以发生在暴露于BBB模型的腔内侧（血液侧）或腔外侧（脑侧）之后，可能是由于小胶质细胞的激活以及细胞因子或趋化因子的释放。重要的是，COVID-19患者的神经病理学可能是由直接感染和病毒驱动的免疫病理学共同驱动的。本研究强调，BBB破坏不需要在SARS-CoV-2直接感染后发生，外周和中枢对SARS-CoV-2的免疫反应可能在COVID-19患者的神经病理学中发挥关键作用。
