基于PCR的UGT1A1基因分型技术开发及rs3064744等位基因在俄罗斯人群中的分布

《Frontiers in Genetics》：Development of a PCR-based technique for genotyping UGT1A1 gene and distribution of rs3064744 alleles in the Russian population

　　

摘要
背景：准确确定UGT1A1启动子区域（rs3064744）中串联胸腺嘧啶-腺嘌呤（TA）重复次数对于诊断吉尔伯特综合征和个体化使用伊立替康和阿扎那韦等毒性药物的治疗至关重要。然而，传统聚合酶链反应（PCR）检测由于富含AT的序列以及高度同源的7TA和8TA等位基因的重叠熔解温度（Tm）而面临严重限制。在此背景下，采用荧光团-淬灭剂系统的熔解曲线分析（MCA）已成为一种有前景的替代方法。本研究的目的是开发一种新型分型方法，将优化的aPCR-MCA分析与自动分类器相结合，以克服高度同源等位基因区分带来的限制，并展示其实用价值，提供俄罗斯人群四个区域队列中rs3064744基因型的分布。
方法：研究人员开发了一种专门的Dual Head 1D-卷积神经网络（1D-CNN）集成模型，并采用测试时增强（TTA）。该模型在1,620个工程化质粒样本上进行训练和内部验证，并在440个独立患者基因组DNA样本的外部临床测试集上进行独立评估。实时PCR在CFX96和DTprime平台上进行。此外，对来自莫斯科、萨哈（雅库特）、达吉斯坦和罗斯托夫地区的997个档案临床样本进行了人群范围筛查。
结果：虽然5TA和6TA等位基因容易分离，但7TA和8TA等位基因的绝对Tm分布显著重叠，且在不同平台上出现0.8°C–1.4°C的非均匀Tm偏移。因此，传统的绝对Tm阈值法不适用。通过评估与共扩增的7TA/7TA和7TA/8TA参考锚点的相对形态曲线差异，1D-CNN集成模型消除了仪器噪声。该模型在内部验证中达到100%准确率，与临床参考焦磷酸测序的440个样本完全一致（440/440）。人群筛查显示，达吉斯坦、雅库特和罗斯托夫队列与欧洲人群高度一致。在雅库特和莫斯科检测到低频的罕见5TA和8TA等位基因。
结论：将LNA修饰的aPCR-MCA与对比性1D-CNN模型相结合，成功规避了热力学限制，并消除了人工操作者偏差。该集成系统为常规UGT1A1药物遗传学检测提供了一种可及、高通量且临床有效的解决方案。

**论文解读：基于不对称PCR-熔解曲线分析与深度学习自动分类的UGT1A1 rs3064744基因分型方法及其在俄罗斯人群中的等位基因分布**

**1. 研究背景**
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1（UGT1A1）是胆红素肝脏葡萄糖醛酸化和多种外源性物质（包括药物）解毒的关键酶。其基因表达受核心启动子区域（TATA-box）中串联胸腺嘧啶-腺嘌呤（TA）重复数多态性rs3064744的显著影响。野生型等位基因通常含6次重复（UGT1A1*1，A(TA)₆TA），而突变等位基因可含5次（UGT1A1*36，A(TA)₅TA）、7次（UGT1A1*28，A(TA)₇TA）或8次（UGT1A1*37，A(TA)₈TA）重复，从而影响基础酶活性。与酶活性降低相关的等位基因（如UGT1A1*28和UGT1A1*37）纯合或杂合是吉尔伯特综合征（GS）的主要遗传因素，这是一种以轻度非结合性高胆红素血症为特征的常见疾病。此外，UGT1A1基因分型在药物遗传学中至关重要：携带UGT1A1*28等位基因的患者在接受伊立替康（一线化疗药物）时，发生严重中性粒细胞减少症等危及生命的不良反应风险显著增加；该等位基因检测也纳入俄罗斯HIV感染治疗指南中，用于指导阿扎那韦的使用。
然而，rs3064744多态性的基因分型面临显著技术挑战。UGT1A1启动子序列富含AT，影响标准TaqMan探针的退火温度和靶标特异性，导致传统实时PCR检测区分能力下降，易产生假阳性或假阴性结果。替代方法如Sanger测序成本高、耗时长；毛细管电泳片段分析易受聚合酶滑脱和stutter峰干扰；其他PCR技术（如SYBR Green熔解、高分辨率熔解、焦磷酸测序、双探针系统）虽扩展了检测手段，但单管低成本、高明确性分型仍具挑战。在此背景下，采用荧光团-淬灭剂系统的熔解曲线分析（MCA）成为有前景的替代方案，尤其结合不对称PCR（aPCR）和锁核酸（LNA）修饰可提高熔解温度（Tm）和特异性。然而，将MCA转化为全自动诊断工作流程仍面临重大挑战：高度同源等位基因（特别是7TA与8TA）的区分常依赖主观人工判读或刚性启发式算法，易受硬件特异性热噪声和荧光基线漂移影响。近年来，深度学习技术为后PCR数据处理提供了强大方法，通过从复杂熔解曲线形态中提取层次化特征，可自动解读基因型并增强分类稳健性，减少操作者依赖的偏差。
本研究旨在开发一种结合优化aPCR-MCA分析与自动分类器的新型基因分型方法，以克服高度同源等位基因区分的限制，并展示其实用价值，提供俄罗斯人群四个区域队列中rs3064744基因型的分布。

**2. 主要关键技术方法**
研究人员开发了以下关键技术方法：（1）采用LNA修饰探针的aPCR-MCA体系，通过不对称引物浓度（限制性正向引物与过量BHQ1标记反向引物比例3:1–4:1）和LNA修饰（6–10个单体）实现单管中四种等位基因（5TA、6TA、7TA、8TA）的清晰熔解峰区分。（2）构建了包含1,620个工程化质粒模型样本（涵盖所有十种基因型）的训练/内部验证集，以及440个来自临床诊断队列（莫斯科“分子诊断中心”2014–2026年样本，因临床指征富集了低功能基因型）的独立外部验证集。（3）开发了基于Dual Head 1D-卷积神经网络（1D-CNN）的集成模型，采用双控制样本比较机制（以7TA/7TA和7TA/8TA为参考锚点），输入11通道张量（包括原始信号、一阶导数、二阶导数及各差值曲线），并经Focal Loss、Mixup增强、TTA等策略提高稳健性。（4）利用全球人群数据（1000 Genomes Project、gnomAD v4.1.1、FMBA基因组数据库）进行等位基因频率比较，并通过HipSTR算法从全基因组测序数据中提取STR长度。

**3. 研究结果**

**3.1 aPCR-based way for rs3064744 genotyping**
通过优化aPCR-MCA条件，研究人员建立了单管三步法：首先通过引物浓度差异实现不对称扩增，积累含淬灭剂的大量单链靶标；随后冷却使LNA修饰探针与靶标杂交，形成荧光淬灭复合物；最后通过控温熔解监测荧光变化，获得与等位基因特异性Tm对应的熔解峰。实验确定了最佳引物比（3:1–4:1）、最佳探针-淬灭剂距离（4–10 nt）、最佳LNA修饰数（6–10个）。对四个等位基因的Tm测量显示，5TA和6TA可明确分离，但7TA和8TA的Tm分布重叠严重（CFX96上7TA/7TA峰高达54.1°C，8TA/8TA峰低至54.2°C；7TA/8TA杂合峰跨52.8–55.5°C），且不同平台间Tm偏移0.8–1.4°C，因此绝对Tm阈值法不适用，需依赖完整熔解曲线形态。

**3.2 Development of a machine-learning model for automatic allele discrimination**
研究人员在1,620个质粒样本上训练了1D-CNN集成模型（五个独立模型，随机种子不同），并与随机森林、XGBoost和LightGBM三种经典算法比较。在内部验证集（n=325）上，1D-CNN达到100%准确率和宏F1分数，而树模型在CFX96平台上出现轻微性能下降（准确率99.1–99.47%），错误集中于7TA/8TA与7TA/7TA或8TA/8TA的区分。在外部独立临床验证集（n=440）上，1D-CNN与临床参考焦磷酸测序100%一致（440/440，95%单侧置信下限99.3%），包括21个7TA/8TA样本。分析灵敏度（LOD）确定为10⁴ copies/mL（实际检测限为准），以确保双等位基因分型的可靠性。

**3.3 Analysis of the frequency distribution of rs3064744 alleles**
基于1000 Genomes Project数据，全球五大超人群等位基因频率呈现显著差异：非洲人群具有最高遗传多样性，7TA等位基因频率超过6TA，且罕见5TA和8TA频率最高；东亚人群高度均一，6TA占主导，7TA频率最低，5TA和8TA缺失；欧洲人群呈中间分布，6TA频率约70%，7TA约30%，5TA<0.5%，8TA未检测到；南亚和混合美洲人群呈现复杂模式。与gnomAD v4.1.1（欧洲人群）比较显示一致性（p=0.9），但与FMBA俄罗斯国家基因组数据库（7TA频率35.9%）存在显著差异（p<0.001）。
针对俄罗斯四个区域队列（达吉斯坦n=202、莫斯科n=369、雅库特n=309、罗斯托夫n=114）的筛查显示：达吉斯坦、雅库特和罗斯托夫地区的基因型分布与欧洲人群无显著差异（p>0.05），6TA等位基因频率约71%，7TA约29%，6TA/6TA纯合子约50%，6TA/7TA杂合子40–43%，7TA/7TA纯合子8–9%。莫斯科和莫斯科地区呈现显著异常：6TA频率降至63%，7TA升至37%，6TA/7TA杂合子成为主要基因型（48%），7TA/7TA纯合子达12.9%，与欧洲参考人群及俄罗斯其他三个地区相比均显著偏离（p<0.001），但与FMBA数据库无显著差异（p=0.55）。罕见5TA和8TA等位基因在雅库特（5TA/6TA 0.3%）和莫斯科（5TA/6TA 0.3%，7TA/8TA 0.3%）被检出，而在达吉斯坦和罗斯托夫完全缺失。

**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，本研究成功克服了UGT1A1 rs3064744基因分型的热力学限制，通过LNA修饰aPCR-MCA实现了所有十种基因型（包括罕见8TA）的单管单探针检测，为多重扩增整合其他药物遗传学变异（如UGT1A1*6、UGT1A1*27）提供了开放平台。与Sanger测序、片段分析、焦磷酸测序相比，该方法具有周转时间短（约2.5小时）、试剂成本低、所需设备单一（实时PCR仪）、通量高（96–384孔）、自动解读等优势，尤其适合区域或偏远诊断实验室。深度学习1D-CNN集成模型通过双控制样本比较机制消除了仪器间Tm偏移和操作者偏差，在外部验证中达到100%临床一致性，优于树模型。
人群频率分析揭示了俄罗斯人群的遗传结构：达吉斯坦、雅库特和罗斯托夫地区与欧洲人群一致，但莫斯科地区7TA等位基因频率显著升高（36.9%），可能与多民族混合和内部迁移有关，且与FMBA数据库一致。然而，FMBA数据库与本研究aPCR-MCA方法结果间的显著差异（p<0.005）提示，传统短读长全基因组测序流程在处理高多态性STR时易受聚合酶滑脱和比对算法偏差影响，可能高估7TA频率、低估6TA频率，从而证实了STR特异性PCR方法的优势。
研究结论：结合LNA修饰的aPCR-MCA与对比性1D-CNN模型成功规避了热力学限制并消除了人工操作者偏差。该集成系统为常规UGT1A1药物遗传学检测提供了一种可及、高通量且临床有效的解决方案。