缺氧诱导的神经酰胺代谢调控：对潜在生物标志物及干预靶点的意义

《Journal of Chromatography B》：Hypoxia-induced modulation of ceramide metabolism: Implications for potential biomarkers and intervention targets

　　

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  开发了用于检测生物样本中活性神经酰胺的 UPLC/MS 方法。
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  揭示了缺氧引起的器官特异性神经酰胺改变。
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  揭示了细胞适应缺氧机制中的神经酰胺动态变化。
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  提出了神经保护治疗的剂量调整策略。

引言

氧气对于维持大多数生物体的正常生理功能至关重要。组织摄入氧气不足会导致代谢、功能和结构的异常变化，这一病理过程被称为缺氧。缺氧在各种环境背景中都很常见，包括潜水、高海拔、太空飞行和洪水。在日常生活中，它常与一系列疾病相关，如癌症、脑梗塞、心绞痛、心力衰竭、哮喘和慢性阻塞性肺疾病 (COPD) [1], [2]。一些研究表明，在缺氧预适应条件下，细胞存活保持稳定，动物的缺氧耐受时间延长，减轻了缺氧对机体的损害 [3], [4]。其作用机制可能与内源性代谢物水平升高及相关通路的激活有关，从而产生抗缺氧保护作用。例如，在缺氧预适应条件下，观察到缺氧诱导因子 (HIF) 调节细胞能量代谢，或通过协调腺苷和一氧化氮信号传导与抗凋亡、氧化应激和免疫反应等过程来产生缺氧保护 [5]。我们之前的研究对缺氧预适应小鼠脑组织进行了代谢组学分析，发现鞘脂代谢途径发生显著变化，表明这与缺氧的代谢反应相关 [6]。

鞘脂是生物体内重要的生物活性成分，在细胞生长、凋亡、增殖、迁移和膜保护等多种生理活动中发挥关键作用 [7], [8], [9]。其中，神经酰胺是神经鞘脂代谢途径中的中心代谢物。除了其在生物膜中的结构作用外，神经酰胺还作为细胞信号传导中的第二信使，影响多种生理和病理过程 [10], [11], [12]。作为一种鞘脂，神经酰胺的分子骨架通过酰胺键连接可变长度的脂链 [13]。根据脂肪酸链中的碳原子数量，神经酰胺可分为短链、长链和超长链神经酰胺。此外，根据脂肪酸链中是否存在双键，它们可分为饱和或不饱和神经酰胺 [14]。

研究表明，在 拟南芥 中，暴露于缺氧条件会导致不饱和超长链神经酰胺 C24:1 的积累，它具有 24 个碳原子的脂肪酸链并包含一个不饱和双键。这种神经酰胺通过调节乙烯信号通路发挥抗缺氧保护作用 [15]。此外，我们实验室之前的代谢组学研究显示，在缺氧适应过程中，小鼠脑中与 CerS2（一种负责合成 C24:1 的神经酰胺合成酶）相关的基因 Lass2 的表达显著上调。而且，C24:1 在缺氧条件下显示出上调的趋势，表明其具有作为内源性缺氧保护因子的潜在作用 [6]。此外，另一项研究表明，亚致死氧糖剥夺 (OGD) 预处理诱导的大鼠原代培养皮质神经元细胞的缺血耐受性与多种神经酰胺种类（如 C16:0, C18:0, C18:1, C24:0, C24:1）的增加密切相关。然而，仍缺乏通过动物实验进行的验证 [16]。在与缺氧相关疾病的几项研究中，这些神经酰胺已被确定为关键的信号分子，在疾病的发生和发展中发挥重要作用 [17], [18]。

尽管已经报道了一些关于神经酰胺测定的研究，但在不同缺氧条件下不同组织中缺氧相关内源性活性神经酰胺（如 C16:0, C18:0, C18:1, C24:0 和 C24:1）浓度变化的系统性研究方面仍存在显著不足 [19], [20], [21]。此外，缺氧条件下小鼠体内活性神经酰胺 C24:1 的药代动力学尚未有记载。以前检测神经酰胺的方法主要侧重于定量体内的总神经酰胺含量，通常使用薄层色谱法，这在分辨率和定量准确性方面存在一定局限性 [22]。随后的液相色谱 - 质谱 (LC-MS) 技术仅限于在较长时间内检测有限数量的神经酰胺种类，这使得它们不太适合广泛的样本筛选 [21], [23]。然而，质谱技术的进步使得超高效液相色谱 - 串联质谱 (UPLC-MS/MS) 成为分析物定量分析的首选技术，因为它具有高灵敏度和特异性 [24], [25]。本研究的目的是开发一种快速、简单且精确的 UPLC-MS/MS 方法，用于同时检测生物样本中的五种神经酰胺，以及调查缺氧条件下小鼠体内内源性和外源性神经酰胺浓度的变化。该方法具有高灵敏度和特异性，方法验证可靠，并已有效用于内源性和外源性神经酰胺的测定。我们的发现不仅阐明了缺氧条件下细胞应激适应的基本规律，也有望有助于制定常氧和缺氧场景下神经酰胺管理的临床指南。

章节摘要

材料与动物

神经酰胺 C16:0, C18:1, C24:1 和 C15-d7（纯度 >98%）购自 Avanti (Metreya Inc., 美国)。神经酰胺 C18:0 和 C24:0（纯度 >98%）购自 Cayman (Ann Arbor, MI, 美国)。乙腈 (LC-MS 级), 甲醇 (LC-MS 级), 异丙醇 (LC-MS 级), 二氯甲烷 (LC-MS 级), 甲酸 (LC-MS 级) 和水 (LC-MS 级) 购自 Fisher Scientific Corporation (Fair Lawn, NJ, 美国)。所有其他试剂和化学品均为分析纯。

雄性 ICR 小鼠

方法开发

由于神经酰胺在细胞过程中的关键作用及其作为各种疾病生物标志物的潜力，在不同物种、组织、血液和细胞中神经酰胺的定量一直是研究的焦点 [26], [27], [28]。作为一种内源性物质，用于定量分析的空白基质通常通过以下方法获得：1. 稀释真实基质作为空白基质 [29]；2. 相关 敲低后的组织或细胞匀浆

结论

神经酰胺作为生物活性信号分子，在缺氧疾病的病理生理学和机体对缺氧条件的生理反应中发挥着关键作用。为了深入研究神经酰胺在缺氧应激反应中的作用，本研究开发了一种用于检测活性神经酰胺的 UPLC/MS 方法，该方法成功应用于常氧和缺氧环境下内源性和外源性神经酰胺的定量。通过分析

CRediT 作者贡献声明

Di Zhang: 写作 – 原稿，调查。 Lu Bai: 写作 – 审阅与编辑，验证。 Qiang Li: 数据整理。 Yi Wu: 软件。 Huixin Tan: 数据整理。 Pingxiang Xu: 监督。 Xuelin Zhou: 可视化。 Xiaorong Li: 监督，软件。 Ming Xue: 方法学，概念化。

资助声明

本研究得到了 国家自然科学基金创新研究群体项目 [批准号 81773803 和 82073925] 的资助。

竞争利益声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本文报道的工作。

致谢

作者感谢首都医科大学设施中心的赵树瑞博士在质谱分析方面提供的技术援助。

Di Zhang|Lu Bai|Qiang Li|Yi Wu|Huixin Tan|Pingxiang Xu|Xuelin Zhou|Xiaorong Li|Ming Xue