《Advanced Biology》：Single-Cell Glycomics of the Pancreatic Tumor Microenvironment: Technologies, Glyco-Immune Checkpoints, and Tumor–Immune Communication
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在本综述中，研究人员总结了单细胞糖组学领域的概念和技术进展，尤其关注新兴策略，这些策略能够解析肿瘤-免疫相互作用中的糖基化信息。研究人员重点介绍了单细胞糖基化与RNA测序（scGR-seq），该方法将糖基化信息转化为可扩增的核酸信号，从而在单细胞水平同时分析转
在本综述中，研究人员总结了单细胞糖组学领域的概念和技术进展，尤其关注新兴策略，这些策略能够解析肿瘤-免疫相互作用中的糖基化信息。研究人员重点介绍了单细胞糖基化与RNA测序（scGR-seq），该方法将糖基化信息转化为可扩增的核酸信号，从而在单细胞水平同时分析转录组和糖组。同时，研究人员引入了GlycoChat，这是一个计算框架，旨在系统性地推断和可视化肿瘤微环境（TME）内的糖基化-凝集素相互作用网络。将这些方法整合应用于胰腺导管腺癌（PDAC）揭示了上皮-间质转化（EMT）过程中广泛的糖基化重塑，并表明基底样PDAC细胞选择性地强化与先天免疫细胞（尤其是肿瘤相关巨噬细胞）上表达的凝集素受体的相互作用。这些EMT驱动的糖基化-凝集素回路被认为在TME中传递免疫抑制信号，并与临床结局密切相关。总体而言，这些进展凸显了糖基化作为免疫调节的主动介质（而非仅是被动的肿瘤标志物），并为理解并可能利用癌症中糖基化介导的免疫调节提供了概念框架。
1 糖基化-凝集素相互作用分析的历史演变
糖基化-凝集素相互作用分析历经数十年发展，受糖基化内在复杂性及糖基化-蛋白质相互作用通常弱且多价的特性驱动（表1）。早期研究主要依赖定性或半定量测定，逐渐被适用于粗生物样品的高通量技术所取代。1936年，在鉴定出刀豆蛋白A（Concanavalin A）为植物血凝素后，血凝集测定及其被糖类抑制的方法被报道用于探测凝集素活性和糖类特异性。凝集素交联红细胞表面糖基化并诱导可见凝集的能力为糖识别提供了简单灵敏的指标。同项研究中还描述了凝集素-糖类沉淀的早期观察，预示了后来利用溶液中多价凝集素-糖基化相互作用的沉淀测定。1960年代，定量凝集素-糖类沉淀测定明确建立，类似于抗原-抗体沉淀反应。尽管广泛用于凝集素表征和分类，但凝集和沉淀测定仅提供定性信息，限制了其精确测定糖基化结合特异性和亲和力的实用性。1968年，平衡透析被用于获得糖基化-凝集素相互作用的定量描述，基于配体在半透膜上的平衡重分布直接估计结合亲和力，但需要大量纯化寡糖和凝集素，劳动强度大，不适用于高通量分析。1986年，前沿亲和层析（FAC）开发，专门用于高灵敏度量化弱糖基化-凝集素相互作用，通过分析荧光标记糖基通过凝集素固定柱的洗脱前沿变化，用最小样品量准确测定解离常数。自动化FAC系统进一步促进了大糖库凝集素特异性的系统映射，为糖识别奠定定量基础。FAC是糖生物学最早的高通量定量技术之一，为后续糖基化相互作用分析平台奠定基础。1989年，等温滴定量热法（ITC）提供无标记方法直接测量结合热力学，得出解离常数及焓和熵贡献，但通常需要高样品浓度且对弱相互作用不敏感。1990年代初，表面等离子体共振（SPR）在宽动态范围内实时监测结合动力学和亲和力，常应用于测定凝集素与固定化糖和糖蛋白的结合亲和力。生物层干涉测量（BLI）最近作为替代无标记平台出现，相比SPR提供更高通量和简化实验流程。后来的阵列式和成像SPR进一步扩展了其在高通量糖基化-凝集素相互作用分析中的应用。与这些表面方法并行，溶液相生物物理方法继续发展用于糖基化-凝集素相互作用的定量和结构表征。天然质谱（MS）成为定量表征糖基化-凝集素相互作用的强大方法，允许同时筛选和定量排序糖基化配体，将MS从糖结构分析扩展到功能糖组学和糖基化相互作用组学。核磁共振（NMR）波谱长期作为原子分辨率下阐明糖基化-凝集素识别的关键技术，近期工作展示了NMR在表征天然糖蛋白和复杂生物系统中糖基化识别结构基础方面的能力。2000年代初，糖基化微阵列作为高通量平台引入，用于分析凝集素的糖基化结合特异性。通过将定义糖基化固定于固体表面，糖基化微阵列使糖基化结合蛋白（包括凝集素、抗体和病毒受体）的全面分析成为可能，但主要在天然细胞环境外探究糖识别。为克服这一限制，基于细胞（细胞）糖基化微阵列利用基因工程在活细胞上展示定义糖结构，实现在更生理细胞环境中分析凝集素-糖基化相互作用。凝集素微阵列于2005年首次报道，作为糖基化-凝集素相互作用分析的互补高通量平台，将具有定义糖特异性的凝集素面板固定以探测复杂生物样品的糖基化模式。凝集素微阵列不解析精确糖结构，而是生成可重现的糖基化指纹，捕获糖基化状态的全局变化。这一概念转变——从精确结构测定到基于模式的糖基化分析——代表了功能糖组学的范式转变，实现了生物和临床样品的快速分析。在基于糖基化-凝集素相互作用的分析方法中，凝集素微阵列是首批专门为糖基化分析设计的实用高通量平台之一。21世纪初，化学生物学策略，尤其是代谢标记，使得在活细胞中探究糖基化-凝集素相互作用成为可能，随后引入了可代谢整合到细胞表面糖基化中的生物正交化学报告基因。最近，邻近标记方法进一步扩展了该框架，可通过识别天然细胞环境中的内源性糖基化-凝集素相互作用伙伴。然而，代谢标记通常每次检测单个糖基化表位，因此对细胞糖组的覆盖有限。总体而言，这些技术反映了从定性观察到定量亲和力测量、结构表征、高通量特异性分析，最终在更生理生物学背景下探究糖基化-凝集素相互作用的逐步演进。尽管分析能力多样，几乎所有传统方法都依赖批量测量，从而掩盖了细胞异质性。这些局限推动了近期单细胞糖组学策略的发展，将糖基化-凝集素相互作用分析扩展到单细胞水平的糖基化分析，使系统解码糖基化-凝集素相互作用网络及糖基化表达景观成为可能。
2 单细胞糖组学和糖免疫检查点的出现
现代单细胞糖组学于2021年出现，伴随着DNA条形码凝集素技术的独立引入，包括单细胞糖基化和RNA测序（scGR-seq）和SUGAR-seq，使直接探测单细胞分辨率下的细胞表面糖基化成为可能。尽管糖基化在塑造肿瘤-免疫相互作用中起核心作用，其分析在技术上仍具挑战性。传统糖组学方法，包括质谱、液相色谱、毛细管电泳和凝集素微阵列，依赖批量测量，掩盖了细胞和亚型特异性异质性。此外，糖基化生物合成不直接由基因组编码，而是由复杂酶网络调控，因此糖结构无法可靠地从转录组数据推断。因此，糖组学仍是单细胞生物学中最后一个基本未探索的分子层。这一技术差距限制了对糖基化介导的免疫调节机制在不同癌症亚型间差异的精确理解，以及糖基化景观在如上皮-间质转化（EMT）等过程中的动态重塑，EMT是一个促进肿瘤进展、转移和免疫逃逸的基本细胞重编程过程，从而阻碍了具有检查点样功能的糖基化免疫调节途径的识别。本文中，研究人员使用“糖免疫检查点”一词描述肿瘤相关糖基化与先天免疫细胞上凝集素受体结合、导致主动抑制抗肿瘤免疫的调节途径。该定义强调功能类比而非经典适应性免疫检查点的分子等同性。本综述综合了单细胞糖组学的最新进展，特别关注糖基化重塑如何重塑肿瘤-免疫相互作用。
3 单细胞糖基化和RNA测序（scGR-seq）
单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现彻底改变了TME研究，能详细绘制细胞组成和转录状态。然而，缺乏可扩展的单细胞糖组学技术限制了肿瘤-免疫相互作用的功能解释。为填补这一空白，开发了单细胞糖基化和RNA测序（scGR-seq）。分析单个细胞中糖基化表达的困难主要源于糖基化缺乏类似PCR的核酸扩增机制。该方法通过将每个具有定义糖特异性的凝集素结合到独特的DNA条形码上，将糖基化信息转化为可扩增的DNA信号。与细胞表面糖基化结合后，这些条形码在基于液滴的单细胞平台中与细胞mRNA一同回收。因此，scGR-seq能够以单细胞分辨率整合分析转录组和糖组景观。概念上，scGR-seq可视为液态凝集素微阵列与单细胞测序的结合。虽然基于抗体或化学标记的方法能准确检测特定糖基化表位，但其糖组覆盖受限于探针可用性。相比这些方法，scGR-seq通过直接检测细胞表面糖基化并并行获取单细胞基因表达数据，实现更全面的糖组分析。抗体对单个糖结构或糖蛋白具有高度特异性，因此全面糖组分析需要针对每种不同糖基化的抗体，需数千至数万种试剂，不切实际。相比之下，凝集素不仅识别特定糖基化基序，也识别结构相关的糖基化，且亲和力各异。因此，相对较小的凝集素库可捕获糖组中的广泛糖基化变化。化学标记方法仅限于检测有限数量的糖基化基序，因此仅提供有限的糖组覆盖。scGR-seq可通过两种形式实施：孔板和液滴基。孔板scGR-seq是单细胞糖基化和RNA测序的首个实现，旨在建立单细胞分辨率下整合糖组和转录组分析的基本可行性。该方法中，细胞与DNA条形码凝集素孵育，凝集素结合特定细胞表面糖基化；结合后，单个细胞分离到单独孔中，UV照射释放凝集素相关DNA条形码；这些条形码通过下一代测序收集和定量，获得单细胞糖基化谱（Glycan-seq）；同一细胞随后通过孔板方法进行单细胞RNA测序，实现同一细胞糖基化和转录组数据的直接整合。孔板scGR-seq提供高分析灵敏度和定量准确性，适用于详细机制研究和概念验证分析。使用该方法，研究人员证明糖基化和RNA信息的整合改善了细胞类型分类，并揭示了细胞分化过程中特定糖基化与基因表达程序之间的紧密相关性。然而，由于细胞必须单独处理，此方法通量受限，每次实验仅数百个细胞。孔板scGR-seq已应用于表征异质细胞群中不同细胞类型和亚群的糖基化特征，包括人诱导多能干细胞来源的神经干细胞和神经元，以及肠道微生物群。为克服通量限制，开发了液滴基scGR-seq，将Glycan-seq与液滴微流控技术整合。在该方法中，大量细胞首先用DNA条形码凝集素标记，然后单独封装到带有条形码凝胶珠的液滴中。在每个液滴内，细胞mRNA被逆转录，同时凝集素衍生的DNA条形码被扩增，使得来自同一细胞的转录组和糖组信息由共享细胞条形码索引。液滴基scGR-seq在单次实验中可并行分析数万个单细胞，适用于复杂和异质样品，如肿瘤组织和免疫细胞群。该高通量实现能够无偏识别细胞类型特异性糖基化特征、检测稀有细胞群，并表征同一细胞类型内的糖基化异质性，这些特征仅凭转录组数据难以捕获。重要的是，液滴基scGR-seq直接测量细胞表面糖基化，即使相应的糖基转移酶基因表达水平极低或检测不到。与其他基于凝集素的方法一样，scGR-seq不直接解析糖基化精细结构，突显了互补结构糖组学方法的重要性。
4 其他单细胞糖组分析技术
这些新兴方法共同表明，目前没有单一技术能捕获细胞糖组的全部结构、功能和空间复杂性。这些技术并非相互竞争，而是提供关于糖基化结构、丰度、可及性和生物功能的正交和互补信息，每个平台根据生物学问题、样品类型和分析深度提供不同见解。除scGR-seq外，已报道了几种用于单细胞糖组分析的互补技术，反映了通过不同实验和计算策略解析单细胞分辨率糖基化异质性的日益增长的兴趣。这些方法在读出示方式、糖基化覆盖、可扩展性和与其他组学层的兼容性方面差异很大。具体包括：SUGAR-seq（基于单个凝集素PHA-L的液滴基单细胞方法，与抗体表面蛋白分析和转录组学整合，已应用于肿瘤浸润T细胞，但单一凝集素探针限制全面糖组分析）；Glycomic-seq（使用DNA条形码抗糖基化单克隆抗体库，实现高通量单细胞糖组分析，与转录组和蛋白质组整合，已识别与转移潜力和癌症干细胞样状态相关的糖基化特征，但受限于试剂可用性、特异性和表位覆盖）；LacNAc-seq（利用化学酶法标记乳糖胺（LacNAc）结构，通过糖基转移酶介导的点击化学糖类似物转移，随后与DNA条形码探针偶联进行测序，提供LacNAc丰度和可及性的互补信息，但覆盖仅限于可被标记酶识别的结构）；CyTOF-Lec（通过飞行时间质谱（CyTOF）适应单细胞糖基化分析，将多个靶向唾液酸、岩藻糖和T抗原的凝集素与金属标记抗体结合，同时测量糖基化特征和蛋白质标志物，但不提供基因表达信息）；CE-MS（毛细管电泳-质谱联用，实现无标记、高灵敏度检测和结构表征从单个或极少量细胞释放的天然N-糖基化，揭示同一类型细胞间的N-糖基化异质性，但当前实施限于N-糖基化，且不易与其他组学层整合）；Glycopacity（从单细胞转录组数据计算推断糖基化特征，基于糖基化生物合成基因的细胞类型特异性表达模式定义“糖基化基因热点”，但低表达水平需要伪批量聚集，限制稀有细胞群分辨率）；机器学习（基于转录组和凝集素结合数据的训练模型，如SUGAR-seq数据，预测糖基化表型，并识别低丰度但功能重要的糖基化调控基因）；成像（如表面等离子体共振成像用于无标记定量测量原位凝集素-糖基化结合动力学，质谱策略如镧系元素编码探针结合单细胞电感耦合等离子体质谱实现单细胞水平糖基化连接检测，但缺乏可扩展性和转录组整合）。这些技术不应被视为竞争替代品，而是探究细胞糖组不同维度的正交方法。基于凝集素的方法如scGR-seq通过模式识别捕获全局糖基化状态，基于抗体的方法如Glycomic-seq提供高度特异性检测，化学酶法如LacNAc-seq选择性探究LacNAc基序，CE-MS直接解析糖结构。因此，每个平台提供关于细胞糖基化的不同但互补的信息。总之，这些多样化的实验和计算方法表明，单细胞糖组学是一个快速扩展的方法学领域，不同技术解决不同生物学问题。尽管当前没有单一平台能同时提供结构、功能、空间和转录组覆盖，但基于凝集素、抗体、化学探针、成像、质谱和数据驱动策略的融合正在稳步推进我们解析复杂组织中糖基化异质性和糖基化介导的细胞相互作用的能力。
5 胰腺导管腺癌的肿瘤微环境
胰腺导管腺癌（PDAC）仍是最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率低于10%。预计到2030年，PDAC将成为美国癌症相关死亡的第二大原因，凸显创新治疗策略的迫切需求。大多数患者在晚期或转移阶段确诊，限制了手术切除和常规化疗的获益。尽管免疫检查点阻断在黑色素瘤和肺癌等多种恶性肿瘤中革新了癌症治疗，但其在PDAC中的临床疗效极其有限。导致这种治疗抵抗的主要原因是PDAC独特免疫抑制的肿瘤微环境（TME）。PDAC TME以显著的细胞和空间异质性为特征，并由致密的结缔组织增生性基质主导，在物理和功能上限制抗肿瘤免疫反应。该微环境富含多种基质和免疫细胞群，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、树突状细胞（DCs）、肥大细胞以及相对稀疏但空间受限的T淋巴细胞。这些细胞群并非孤立作用，而是通过细胞因子、趋化因子、细胞外基质重塑和直接细胞-细胞相互作用进行协调串扰，从而建立多层次调节网络，抑制免疫激活、损害抗原呈递，并促进细胞毒性T细胞的功能障碍或排除。在PDAC TME中的免疫细胞群中，TAMs尤为丰富，构成主要的免疫调节区室。大量证据表明，TAMs通过优先采用免疫调节性M2样表型，充当免疫抑制的核心协调者。通过抑制T细胞浸润和效应功能、分泌免疫抑制介质、重塑细胞外基质以及强化基质屏障，TAMs在维持免疫逃逸中发挥关键作用。重要的是，TAM表型表现出显著的可塑性，并受邻近癌细胞和基质元素信号的动态塑造。这种可塑性使TAMs不仅作为TME的响应者，还作为整合传感器，能够选择和放大肿瘤衍生的信号，从而主动强化PDAC中的免疫“冷”状态。
6 肿瘤相关糖基化
除细胞因子和蛋白质-蛋白质相互作用外，额外的分子信息层有助于塑造这一复杂微环境中的免疫调节。糖基化是这一复杂微环境中普遍存在但未被充分认识的分子信息层。这些高度多样化的碳水化合物结构，共价连接于蛋白质和脂质，形成糖蛋白和糖脂，装饰所有细胞表面。与核酸和蛋白质不同，糖基化不受限于线性序列，而是采用通过广泛糖苷键生成的分支结构，产生非凡的结构多样性。糖基化生物合成不是模板驱动的，而是由数百种糖基化基因编码的酶协调活动调控，包括糖基转移酶、糖苷酶、产生磷酸化、硫酸化或乙酰化糖基化的糖修饰酶、参与糖代谢途径的酶以及糖转运蛋白。糖基化的调控因此高度多层次，涵盖糖基化基因的转录和转录后控制、底物可用性以及生物合成酶在细胞内的运输和定位。这些特征共同创造了动态且上下文依赖的糖组景观，产生了糖基化微调细胞-细胞相互作用和微环境信号的新兴调控机制。在癌症发生和发展过程中，TME内的癌细胞、基质细胞和免疫细胞中发生广泛的糖基化改变。异常糖基化是癌症的标志，并产生肿瘤相关糖基化特征。在PDAC中，糖基化改变包括截短O-糖基化（Tn/STn）的扩增表达、唾液酸路易斯结构（sLeA/sLeX）、通过己糖胺生物合成通量增加的O-GlcNAc修饰、高分支N-糖基化、岩藻糖基化N-和O-糖基化以及高唾液酸化。值得注意的是，这些改变可在早期甚至癌前阶段出现，并逐步重塑TME。致癌KRAS突变重塑细胞表面糖基化。肿瘤相关糖基化参与肿瘤进展的几乎每个阶段，并建立糖免疫网络，塑造免疫识别和功能。
7 绘制PDAC TME的单细胞糖组
在这些方法中，scGR-seq在复杂组织中研究糖基化介导的细胞-细胞相互作用方面具有广泛适用性，已应用于细胞系、外周血单核细胞（PBMCs）、iPSC衍生细胞和肿瘤组织。本综述描述液滴基scGR-seq应用于手术切除的PDAC组织，并概述TME中恶性细胞群和非恶性细胞群的糖基化表达全面图谱。整合转录组分析识别了19种不同细胞类型，包括癌症亚型、多种T细胞亚群、癌症相关成纤维细胞（CAF）亚型和异质性巨噬细胞群，突显了PDAC的细胞复杂性。在恶性细胞群中，PDAC细胞分为经典型、中间型和基底样亚型，每种展现不同的糖组特征。基于凝集素反应性的单细胞糖基化分析揭示，癌细胞对特定凝集素表现出选择性结合，而非恶性细胞显示更广泛的凝集素结合模式，表明癌症特异性异常糖基化。经典型亚型以与凝集素rBC2LCN的强结合为特征，与先前报道的H型3 O-糖基化富集一致。该亚型还显示特征性α2-6唾液酸化糖基化和Core 2 O-糖基化表达。相比之下，向基底样亚型的进展伴随着活跃的糖基化重编程，导致与α2-3唾液酸特异性凝集素（PVL、MAL、MAH和rACG）的结合显著增加，这与α2-3唾液酸转移酶基因ST3GAL4表达升高相关。此外，基底样PDAC细胞显示与Tn抗原特异性凝集素HPA的显著结合，与C1GALT1（负责将Tn抗原转化为Core 1 O-糖基化的酶）表达降低相关。总体而言，这些发现表明，在EMT过程中，PDAC细胞主动重编程其细胞表面糖基化，从而获得与免疫细胞上表达的凝集素受体相互作用的能力。这一系统性单细胞糖组分析凸显了糖基化不仅是被动的肿瘤标志物，而是动态的功能性分子决定因子，塑造癌细胞表型并有助于建立免疫抑制性肿瘤微环境。
8 GlycoChat：解码糖基化-凝集素相互作用网络
近年来，越来越明显的是，癌细胞表面表达的糖基化与免疫细胞上表达的人类凝集素受体相互作用，抑制免疫细胞功能，从而促进肿瘤免疫逃逸。然而，缺乏能够系统性分析这些糖基化-人类凝集素受体相互作用的单细胞分辨率技术。这些糖基化-人类凝集素受体相互作用被认为通过不同于传统基于癌细胞-免疫细胞蛋白质-蛋白质相互作用的免疫检查点（如PD-1/PD-L1）的机制调节免疫反应。在这些途径中，唾液酸-SIGLEC7/9轴已被实验验证为免疫抑制检查点，其抑制剂开发正在积极进行。然而，人类配备有广泛的凝集素和凝集素样受体库，包含超过200种分子，属于19个已鉴定的凝集素类别（110种已确认凝集素和105种候选凝集素），包括SIGLECs和C型凝集素。因此，癌细胞表面糖基化预计以复杂方式与多种受体相互作用。然而，此前没有技术能够全面分析这些糖基化-凝集素相互作用的单细胞分辨率。为应对这一挑战，开发了GlycoChat作为计算框架，用于系统性分析和可视化TME内的糖基化-人类凝集素受体网络。GlycoChat由三步分析工作流程组成：(i) 使用DNA条形码人类凝集素受体作为结合探针的scGR-seq分析，(ii) 癌症亚型与免疫细胞间相互作用强度的估计，以及(iii) 基于与癌症亚型相互作用潜力对人类凝集素受体进行排序。随后进行功能验证实验。通过整合人类凝集素受体在胰腺癌亚型中的结合亲和力与免疫细胞中凝集素受体基因表达谱，GlycoChat能够定量估计PDAC细胞与免疫细胞群之间的糖基化介导相互作用强度。该分析预测，经典型PDAC细胞与富含凝集素的先天免疫细胞（尤其是TAMs）的相互作用有限，而中间型和基底样PDAC细胞与多种免疫细胞类型表现出强相互作用。在基底样胰腺癌中，预测与M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和肥大细胞存在强糖基化依赖性相互作用。鉴于它们在肿瘤内的丰度和作为治疗靶点的可行性，研究人员将分析重点放在TAMs上。相比之下，肥大细胞在肿瘤免疫中的角色及其治疗实用性尚未完全确立，使得干预结果预测具有挑战性。基于这些考虑，TAMs被选为本分析的主要焦点。接下来，基于人类凝集素受体对癌症亚型的结合亲和力以及免疫细胞中凝集素受体的基因表达水平和特异性，对与胰腺癌亚型相互作用的凝集素受体进行排序。尽管经典型胰腺癌与人类凝集素受体的相互作用有限，但基底样胰腺癌与多种凝集素受体表现出强相互作用。应注意，糖基化-人类凝集素受体相互作用本质上是弱的，且通常依赖于多价结合、受体聚集和局部糖基化密度。GlycoChat不明确建模这些相互作用的热力学或动力学参数，如解离常数、亲和力效应或受体组织。相反，它通过整合scGR-seq获得的凝集素结合谱与免疫细胞群中的凝集素受体表达模式来估计相互作用潜力。因此，推断的相互作用得分应解释为糖基化-凝集素通讯潜力的相对估计，而非结合亲和力或生物物理相互作用强度的直接测量。
9 CLEC10A和SIGLEC3定义巨噬细胞导向的糖免疫检查点候选物
在识别的多个候选人类凝集素受体中，选择CLEC10A和SIGLEC3进行深入分析。聚焦这些受体的理由有四点：(i) 它们主要在CD163阳性TAMs中表达，(ii) 它们与基底样胰腺癌表现出高相互作用强度，(iii) 功能分析证实它们直接参与促进巨噬细胞免疫抑制性极化和降低吞噬活性，以及(iv) 临床标本分析显示它们与患者预后明确相关。功能分析进一步揭示，基底样胰腺癌通过CLEC10A和SIGLEC3作用于巨噬细胞，分别诱导向免疫抑制性M2样表型分化并抑制对癌细胞的吞噬活性。值得注意的是，将基底样PDAC细胞与巨噬细胞共培养增强了CLEC10A和SIGLEC3与基底样PDAC细胞的结合。考虑到胰腺癌在从经典型向基底样状态转变过程中获得与多种人类凝集素受体相互作用的能力，这些发现表明癌细胞并非仅仅是被动适应免疫抑制环境的实体。相反，它们通过重塑其糖基化结构，诱导通过免疫细胞上表达的凝集素受体传递免疫抑制信号，从而主动塑造免疫抑制性TME。因此，EMT被认为作为糖免疫检查点调控的重要上游贡献者，重编程癌细胞通过糖基化界面与巨噬细胞凝集素受体相互作用以促进免疫抑制。这些观察促使研究人员重新将EMT解释为不仅驱动表型可塑性，而且是将转录重编程与免疫调节输出耦合的协调程序。为评估CLEC10A的临床意义，分析了临床胰腺癌标本。该分析揭示，PDAC细胞上CLEC10A配体与TME中表达CLEC10A的CD163阳性巨噬细胞的联合存在与患者预后显著相关。具体而言，CLEC10A配体和表达CLEC10A的单核细胞均高表达的患者显示显著更短的总生存期，表明预后不良。相反，两者或其一低表达的患者显示相对较好的结局。此外，使用来自GEO数据库的177名胰腺癌患者RNA-seq数据对无复发生存期（RFS）进行的Kaplan-Meier分析表明，SIGLEC3高表达患者比低表达患者生存期显著更短。总体而言，这些发现表明糖基化-凝集素受体相互作用状态可能影响胰腺癌的临床结局。这些结果支持CLEC10A和SIGLEC3不仅代表分子机制，而且是具有实际临床意义的疾病相关途径。
10 EMT作为驱动糖免疫检查点的适应性免疫逃逸程序
尽管讨论聚焦于PDAC，但积累的证据表明，在包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌和胰腺癌在内的多种上皮癌中，EMT伴随细胞糖组的广泛重塑。EMT相关的糖基化重塑涵盖糖基化途径的协调改变，包括在上皮细胞向间充质细胞状态转变过程中发生的唾液酸化、岩藻糖基化、O-糖基化截短和糖基化分支的变化。这些糖基化改变与不同癌症环境中的侵袭性增强、转移潜力和免疫逃逸相关。从进化和系统层面看，EMT不仅可视为增强运动和侵袭性的表型程序，也可视为对TME内选择压力的适应性反应。经历EMT的癌细胞遭遇增加的免疫监视和炎症应激，创造了有利于获得免疫保护特性的条件。多项研究表明，EMT与能够与免疫凝集素受体相互作用的糖基化表达增加相关，尤其是与髓系细胞上抑制性SIGLECs相互作用的唾液酸化糖基化。这些观察支持了EMT伴随的糖基化改变可能直接贡献于免疫调节而非仅为细胞去分化的被动副产物的观点。近期PDAC的单细胞糖组分析进一步支持这一概念。在研究中，间充质样肿瘤细胞群（基底样亚型）显示独特的糖基化特征，并表现出与巨噬细胞表达凝集素受体（包括CLEC10A和SIGLEC3）的增强预测相互作用。这些观察表明，EMT相关的糖基化重塑可能强化肿瘤细胞与TAMs之间的糖基化-凝集素通讯，从而促进免疫抑制性微环境。然而，应注意，EMT、糖基化重塑和免疫抑制之间的因果关系尚未完全确立，需要进一步实验验证。基于这些发现，研究人员提出一个概念框架，其中EMT相关的糖基化重塑作为分子界面，将转录可塑性转化为糖基化介导的免疫调节信号。在该模型中，EMT驱动的糖基化改变增加了与先天免疫细胞表达的凝集素受体的结合，强化巨噬细胞介导的免疫耐受并促进免疫逃逸。因此，糖免疫检查点可能代表上皮可塑性转化为TME内持久免疫抑制信号的一种机制。未来跨多种肿瘤类型的研究将需要确定该机制在多大程度上代表上皮癌演化的普遍特征。
11 糖免疫检查点与治疗视角
糖免疫检查点是指肿瘤相关糖基化与先天免疫细胞上凝集素受体结合以抑制抗肿瘤免疫的调节途径。靶向如SIGLEC7/9/15和半乳糖凝集素-1/-3/-9等凝集素受体的策略已在肿瘤免疫治疗中显示疗效，多项临床前或临床研究正在进行中。在PDAC中，涉及SIGLECs、半乳糖凝集素和C型凝集素的糖基化-凝集素相互作用同样被报道在塑造TME中发挥关键作用（表3）。尽管多种糖基化-凝集素相互作用贡献于免疫调节，本综述聚焦于CLEC10A和SIGLEC3作为巨噬细胞导向糖免疫检查点的范例，有单细胞糖组学分析证据支持。由CLEC10A和SIGLEC3介导的免疫抑制机制在本质上区别于经典适应性免疫检查点如PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80-86，后者主要靶向T细胞。相反，这些途径被认为作为“糖免疫检查点”在上游调节先天免疫，特别是巨噬细胞功能。PDAC对免疫检查点抑制剂抵抗的因素之一是T细胞向肿瘤组织浸润低。相反，观察到大量TAMs浸润，这有助于建立免疫抑制性微环境。这些观察表明，糖基化-人类凝集素受体相互作用可能构成该现象的部分分子基础，靶向TAMs中的糖免疫检查点可能代表一种补充和增强现有免疫疗法疗效的策略。未来，结合PD-1/PD-L1抑制剂与靶向CLEC10A或SIGLEC3的治疗方法（如抑制性抗体、糖基化模拟物、肿瘤特异性抗糖基化抗体和肿瘤糖基化靶向的CAR-T细胞）可能被探索。这些方法预期可重编程TAMs的免疫抑制特性，从而将胰腺癌TME转化为更有利于有效免疫反应的状态。
12 scGR-seq和GlycoChat平台的局限性
scGR-seq和GlycoChat平台存在若干局限性。首先，scGR-seq中使用的凝集素是糖基化结构的替代标志物，不化学鉴定单个糖基化部分。其次，使用Fc融合凝集素进行的结合分析可能不完全再现生理条件下与细胞表面凝集素受体的相互作用。第三，scGR-seq本身不提供空间信息，因此需要与空间转录组学或相关方法整合以阐明
