农业喷灌系统作为嗜肺军团菌的环境储存库和气溶胶传播源

《Journal of Environmental Management》：Agricultural sprinkler irrigation systems as environmental reservoirs and airborne dissemination sources of Legionella pneumophila

　　

喷灌系统对现代农业至关重要，但它们在很大程度上是未被充分认识的水生环境，能够维持机会性人类病原体的生存。其中，嗜肺军团菌（*Legionella pneumophila*）尤为令人关注，因为它能够定殖于人工水系统，在波动的环境条件下持续存在，并通过气溶胶传播。本研究对西班牙东北部农村地区两个采样区的灌溉池塘和沟渠进行了全面的微生物学和基因组学调查。宏基因组分析揭示了高度多样化的微生物群落，包含超过20,000个物种，其中21种具有临床意义的空气传播细菌病原体。值得注意的是，在两个区域均检测到嗜肺军团菌，相对丰度高达4.6%。基于培养的分离方法确认了嗜肺军团菌血清群1型（serogroup 1）、庞蒂亚克群（Pontiac group）、贝尼多姆亚群（Benidorm subgroup）、序列型15（sequence type 15）的存在。系统发育分析表明，该环境菌株与2015年一次军团病暴发期间获得的临床分离株关系密切，而该次暴发此前一直未确认环境来源。暴露期间的气象数据显示，风况有利于气溶胶从灌溉农田向居民区进行长距离扩散。研究结果证明，灌溉基础设施可作为嗜肺军团菌及其他空气传播病原体的环境储存库和传播途径。这些发现强调，有必要将农业灌溉系统纳入常规环境监测、暴发调查和公共卫生风险评估中。

**农业喷灌系统：被忽视的嗜肺军团菌环境储存库与气溶胶传播源——一项结合宏基因组学、培养组学与基因组流行病学的综合研究**

**一、研究背景与科学问题**

农业灌溉系统是保障粮食生产的关键基础设施，但同时也构成了人工水生生态系统，能够滋养包括对人类健康具有潜在威胁的机会性病原体在内的多样化微生物群落。微生物在这些环境中的持续存在受到营养物质可利用性、水动力学特性以及生物膜形成等因素的共同影响，这些因素 collectively 为具有致病潜力的细菌创造了适宜的定殖生态位。

传统上，农业灌溉相关的公共卫生风险主要聚焦于食源性病原体通过受污染灌溉水对农作物的污染。然而，随着灌溉现代化进程的推进，传统重力灌溉正逐步被喷灌和滴灌等加压系统所取代，这一转变引入了全新的暴露维度。喷灌系统在运行过程中会产生大量细小的气溶胶颗粒，这些颗粒能够携带微生物并使其在空气中远距离传播。尽管这一潜在传播途径具有重要的公共卫生意义，但农业灌溉基础设施——特别是喷灌系统和灌溉池塘——作为空气传播病原体暴露源的作用在很大程度上仍未得到充分探索。

在众多机会性病原体中，军团菌属（*Legionella*）尤为值得关注。该菌属能够定殖于人工水系统，在波动的环境条件下持续存在，并通过吸入受污染气溶胶传播给人类，导致一种严重的肺炎——军团病（Legionnaires' disease, LD）。嗜肺军团菌是军团病的主要病原体，已有超过68种军团菌被描述，其中28种可引起人类感染。军团病在易感人群中具有较高的病死率，既往暴发事件多与冷却塔、喷泉和娱乐设施等人为气溶胶产生源相关。

近年来，高通量测序和宏基因组学方法的进展极大地拓展了研究人员表征环境水源微生物多样性的能力。这些方法不仅能揭示优势类群，还能检测到传统培养方法可能忽视的低丰度病原体。对于军团菌而言，将宏基因组学与选择性培养和基因组分析相结合尤为重要，因为分离株的获得对于流行病学调查和建立与临床菌株的系统发育关联至关重要。

基于上述背景，本研究旨在通过综合宏基因组学、培养组学和全基因组测序的方法，全面分析西班牙东北部灌溉池塘和沟渠中的微生物群落，识别可能通过气溶胶传播给人类的空气传播细菌病原体，并深入研究环境中分离的嗜肺军团菌的遗传和系统发育关系。此外，研究人员还进行了回顾性流行病学调查，以阐明灌溉基础设施在2015年该农村地区一次军团病暴发中可能发挥的作用。

**二、主要关键技术方法**

本研究采用了多学科交叉的技术策略。**样本采集**方面，研究人员于2025年3月至4月间，在西班牙东北部一个连续灌溉区域的两个分区（1区和2区）采集了地表水样本（深度0.1-0.2米）和沟渠壁拭子样本，其中2区还额外采集了灌溉池塘水样本。**培养分离**遵循ISO 11731:2017标准方案，水样本经0.2 μm孔径膜过滤浓缩后，接种于甘氨酸-万古霉素-多粘菌素-放线菌酮（GVPC）琼脂平板，并在35°C和室温下双份培养以最大化回收环境分离株。**宏基因组分析**方面，直接从浓缩水样本中提取总DNA进行鸟枪法测序，使用fastp进行质量过滤、MEGAHIT进行组装、MetaGeneMark进行基因预测、MMseq2进行基因聚类，并与Nr数据库比对获得分类学注释和丰度信息。**军团菌表型和基因型鉴定**采用乳胶凝集试验确定血清群，使用Dresden小组的单克隆抗体（MAbs）进行群和亚群分型，通过序列分型（SBT）技术依据七个基因的等位基因谱确定序列型（ST）。**全基因组测序**采用Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序平台（MinION，R10.4.1流动池）和Illumina短读长测序平台（MiSeq，2×250 bp双端读长），经过组装、校正和注释后，进行单核苷酸多态性（SNP）分析、全基因组共线性分析和质粒比较分析。此外，研究还整合了西班牙国家气象局（AEMET）提供的气象站数据和Google Earth历史影像，用于土地利用和气象条件的回溯分析。

**三、研究结果**

**3.1 灌溉水中微生物群落特征**

宏基因组分析揭示了灌溉系统中高度复杂的微生物生态系统。在1区检测到16,282个物种的遗传物质，其中11,801个属于细菌界，此外还包括真菌（618种）、古菌（189种）、病毒（427种）等。在2区检测到20,384个物种，其中14,419个属于细菌界。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）在两个区域均占主导地位，在1区相对丰度为70.9%-78.7%，在2区为32.8%-83.2%；拟杆菌门（Bacteroidetes）次之。在属水平上，1区鉴定出2,291个细菌属，其中102个对人类具有潜在致病性，最丰富的属包括黄杆菌属（*Flavobacterium*，13%）、假单胞菌属（*Pseudomonas*，11.4%）和噬氢菌属（*Hydrogenophaga*，3.2%）。2区鉴定出2,598个细菌属，其中104个具有潜在致病性。

值得注意的是，两个区域均检测到多种可通过气溶胶空气传播的临床相关病原菌，共21种（表1），包括鲍曼不动杆菌（*Acinetobacter baumannii*）、肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*）、铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）、嗜麦芽窄食单胞菌（*Stenotrophomonas maltophilia*）等，多数与免疫受损患者的机会性感染相关。在军团菌属方面，1区鉴定出47种军团菌，其中嗜肺军团菌占16%；2区军团菌DNA检出102,564次，鉴定出55种，嗜肺军团菌占5.3%。在2区的M3水样本中，军团菌属相对丰度高达4.6%，占据主导地位。通过培养法成功分离出多种细菌，其中一株军团菌经表型和基因型鉴定为嗜肺军团菌血清群1型、庞蒂亚克群、贝尼多姆亚群、序列型15（ST15）。

**3.2 2015年军团病暴发的环境与流行病学重建**

回顾性分析揭示，2015年8月该农村地区发生了一起军团病暴发，导致5例确诊病例。患者微生物学调查鉴定出两株嗜肺军团菌SG1菌株：Pontiac Benidorm ST15和Pontiac Knoxville ST20。当时的官方环境调查仅关注患者住所附近的潜在城市来源，对冷却塔进行了两次检查和采样，分离出4株军团菌分离株，但最终未能确定感染来源。

研究人员对可能的感染期（2015年8月9-18日，基于2-10天潜伏期推算）的土地利用和气象条件进行了重新评估。土地利用分析显示，城镇北部和东部为喷灌农业用地，且距居民区最近的喷灌农田约500米，最近灌溉池塘不足1公里。气象数据分析显示，8月13-14日出现最高风速，平均风速达3.1 m/s，阵风达12.2和13.6 m/s，显著超过6月（1.78 m/s）、7月（1.82 m/s）和8月（1.54 m/s）的月平均值。盛行风向为11°-36°（东北方向），即从灌溉农田吹向居民区的方向。结合该时期为玉米灌浆期和紫花苜蓿生长关键期，灌溉活动频繁，这些环境条件为喷灌产生的含菌气溶胶向居民区长距离传播提供了合理的物理学基础。

**3.3 嗜肺军团菌ST15分离株的基因组特征**

研究人员对从灌溉区分离的环境ST15菌株（SP_HU-R1B-25）和2015年暴发期间回收的临床ST15菌株（SP_HU-6693-15）进行了全基因组测序和比较分析。环境分离株携带3.38 Mb的染色体和两个质粒（96.31 kb和59.61 kb）。全基因组比较显示，环境分离株与2013年收集的两株西班牙临床ST15分离株最为接近，仅相差22和23个SNP；而与2015年暴发的临床ST15分离株相差468个SNP。此外，环境分离株基因组中检测到两个区域（91.71 kb和24.21 kb）为其他ST15基因组所不具有。在质粒层面，59.61 kb质粒同时存在于环境分离株和2015年临床分离株中，且序列几乎一致，而其他西班牙ST15分离株则缺乏该质粒；96.31 kb质粒仅存在于环境分离株中，大部分序列与2007年新西兰一株临床长滩军团菌（*L. longbeachae*）的两个质粒具有部分序列相似性。

**四、讨论与结论**

本研究表明，农业灌溉基础设施，特别是喷灌系统，可充当嗜肺军团菌及其他空气传播病原体的环境储存库和传播途径。喷灌系统在运行过程中产生的细密气溶胶，在有利的气象条件下（如适当的的风速和风向）能够将病原体输送到相当远的距离，增加社区暴露风险。虽然全基因组比较分析未能在染色体水平上直接证明环境菌株与2015年暴发临床菌株之间的直接关联，但两者共享的59.61 kb质粒为可能的流行病学关联提供了支持。这一发现与既往研究一致，表明军团菌可在水生环境中长期持续存在，且环境与临床种群可能在不同的选择压力下独立进化。

从公共卫生角度看，这些发现具有直接的管理意义。灌溉基础设施应被系统地纳入军团菌风险评估框架和环境监测计划中。控制策略应考虑储水设施管理（如池塘设计、水处理、树木等物理屏障、夜间灌溉、避免在大风天灌溉）以及居民区附近气溶胶扩散的缓解措施。将微生物学、水文学和气象学数据相结合的综合性监测方法，对于改善农村环境的来源归因和暴发预防至关重要。

本研究的局限性包括：暴发调查的回顾性性质限制了对灌溉基础设施与人类病例之间直接流行病学关联的确定；暴露期间未进行气溶胶或空气采样，无法直接证明空气传播；未进行定量微生物风险评估（QMRA）。然而，本研究为未来QMRA提供了必要的危险识别和风险表征基础。总之，这项研究填补了军团病农村流行病学中的关键知识空白，为理解农业灌溉系统在病原体传播中的作用提供了重要的科学依据。