《Journal of Food Protection》：Transcriptomic Analysis of
Salmonella Typhimurium After Exposure to Blue Light
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摘要
抗菌蓝光（aBL）在405 nm波长下可降低包括沙门氏菌（Salmonella）在内的食源性病原菌的活性。包括蓝光在内的可见光可通过内源性光敏剂激发后产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）的机制杀灭细菌。然而，沙门氏菌对a
摘要
抗菌蓝光（aBL）在405 nm波长下可降低包括沙门氏菌（Salmonella）在内的食源性病原菌的活性。包括蓝光在内的可见光可通过内源性光敏剂激发后产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）的机制杀灭细菌。然而，沙门氏菌对aBL的分子响应在很大程度上尚不清楚。本研究旨在表征鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）菌株14028s经亚致死剂量405 nm aBL暴露后的差异基因表达，并评估所选上调基因的表型相关性。将细胞悬浮液在21°C下暴露于aBL（252 J/cm2），并从aBL处理和未处理的细菌悬浮液中提取RNA。构建文库，并在Illumina NextSeq 2000平台上进行双端测序的RNA-seq分析。使用DESeq2进行差异基因表达分析，以倍数变化（|log2FC| > 1, FDR < 0.05）视为差异表达。RNA-seq分析揭示了亚致死aBL暴露后基因表达模式的显著变化。总体而言，238个基因上调，1077个基因显著下调（|log2FC| > 1, FDR < 0.05）。功能注释分析表明，24个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）主要涉及催化活性。值得注意的是，katG基因编码参与过氧化氢水解和整体氧化应激防御的过氧化氢酶，显著上调（log2FC = 4.5）。L-抗坏血酸分解代谢操纵子（ulaBEGR）中四个基因及两个参与氧化应激响应的基因（ahpF, ahpC）的表达显著增加。缺乏katG、ulaB、ulaE、ulaG或ulaR的突变株对aBL处理的敏感性高于野生型对照菌株（P < 0.05）。本RNA-seq分析为沙门氏菌对aBL暴露响应的分子机制提供了有价值的研究发现。理解aBL的抗菌机制可能有助于通过识别可帮助克服细菌对aBL响应的因素或联合处理策略，为制定更有效的食品安全保障措施作出贡献。
**论文解读：鼠伤寒沙门氏菌对405 nm抗菌蓝光的转录组学响应及表型验证**
**一、研究背景与目的**
食品安全领域面临食源性病原菌持续污染的挑战，特别是沙门氏菌（Salmonella enterica）作为美国最主要的食源性致病菌之一，在低水分活度食品（如香料、坚果、粉末类产品）中可长期存活数月之久，对传统消毒策略构成显著挑战。基于光的非热杀菌技术，特别是发光二极管（light-emitting diodes, LEDs）光源，因其成本低廉、可持续性、操作安全性以及可穿透部分透明包装材料的特性，正逐步成为传统方法的替代方案。其中，抗菌蓝光（antimicrobial blue light, aBL）作为一种新型干预策略，属于波长400至470 nm的可见光范畴，凭借其单色性、安全性及经济性等优势，在微生物灭活领域受到日益广泛的关注。尽管研究已提出aBL的杀菌机制涉及内源性光敏剂吸收光能后激发卟啉分子，进而通过光敏化过程产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），如过氧化氢、单线态氧和羟基自由基等，从而对细菌DNA、RNA及蛋白质等关键细胞组分造成氧化损伤，最终导致细胞死亡，然而aBL的具体抗菌机制尚未完全阐明，尤其是沙门氏菌在aBL胁迫下分子响应机制仍存在大量空白。已有研究通过比较不同食源性细菌对405 nm aBL的敏感性发现，沙门氏菌属于耐受性较强的菌种之一，表明其可能存在独特的防御应对机制。此外，目前关于aBL的转录组学研究相对有限，已有的少数工作集中于其他菌种（如空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等）或不同实验条件，更凸显了系统解析沙门氏菌全基因组转录响应的必要性。因此，本研究旨在通过RNA-seq全转录组测序技术，系统分析鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）菌株14028s在液态悬浮体系中经亚致死剂量405 nm aBL处理后的全基因组转录变化，并结合基因敲除突变株的表型验证，识别参与aBL响应的重要功能基因及代谢通路，为深入理解aBL抗菌机制并优化食品安全保障措施提供基础数据和理论依据。
**二、主要技术方法**
本研究所采用的关键技术方法主要包括以下几个环节。菌株选用鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株14028s（来源于佐治亚大学食品安全中心菌种库），经胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth, TSB）培养后，菌悬液以1:20稀释至磷酸盐缓冲液中，置于24孔板内于405 nm LED光源（H?nle UV Technology）下进行aBL暴露处理（辐照度约70 mW/cm2，时长1小时，总剂量约252 J/cm2）。针对转录组分析，利用RNA Protect Bacteria Reagent稳定RNA后，通过RNeasy Mini Kit提取总RNA，经质量检测（A260/280比值1.9–2.1）及完整性评估后，由佐治亚大学基因组学与生物信息学核心（Georgia Genomics and Bioinformatics Core, GGBC）完成核糖体RNA去除和cDNA文库构建，并利用Illumina NextSeq 2000平台进行50 bp双端测序。测序数据经质控、比对至参考基因组（NCBI RefSeq NC_016856.1），通过DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析，筛选阈值为|log2FC| > 1且FDR < 0.05。基因本体论（gene ontology, GO）富集分析采用PANTHER数据库完成。此外，本研究所用的基因敲除突变株（ΔkatG、ΔulaR、ΔulaG、ΔulaB、ΔulaE）由Michael McClelland博士团队（加州大学尔湾分校）构建提供，并通过全基因组测序（WGS）结合BLAST比对确认缺失目的基因；随后将野生型和各突变株在相同aBL暴露条件下进行活菌计数比较，每个菌株设置三个独立实验、三个平行样品。
**三、研究结果**
**3.1 活性检测、RNA-seq标准化与DESeq2分析**
经1小时亚致死aBL暴露后，鼠伤寒沙门氏菌平均活力降低1.79 ± 0.4 Log CFU/mL。随后对处理和未处理细胞进行RNA提取和转录组测序。标准化后的计数显示测序深度均匀、技术噪声极低（箱线图），密度曲线呈现出处理组与对照组之间整体表达分布的适度移动，表明405 nm aBL引起了广泛但温和的转录组重塑。以|log2FC| > 1和FDR < 0.05为标准，共识别出1,315个差异表达基因（DEGs），其中238个基因显著上调（log2FC范围为1.00至5.68），1,077个基因显著下调（log2FC范围为-8.08至-1.00）。上调最为显著的基因包括katG、ahpF、ibpB和ibpA，而下调显著的基因包括saaA和pagD，展示了S. Typhimurium在aBL胁迫下独特的转录响应特征。
**3.2 基因本体论（GO）分析**
GO分子功能富集分析显示，上调基因主要富集于催化活性类别（为最大的分子功能类群），其次是结合活性，还有少量基因注释为转运蛋白、转录调节因子、电子传递蛋白、抗氧化蛋白和ATP依赖性酶。下调基因同样以催化活性和结合活性为主，另有电子传递蛋白、ATP依赖性酶、结构分子、转录调节因子等功能类别。上调基因的GO过度表达分析识别出两个显著富集的生物学过程：甘油代谢过程（富集倍数19.62，FDR = 0.037）和蛋白质成熟（富集倍数6.56，FDR = 0.016）。下调基因的过度表达分析则显示翻译过程显著富集，表明蛋白质合成被广泛抑制；此外，嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成过程、核糖核苷酸和核酸生物合成过程均显著富集。能量代谢方面，氧化磷酸化、ATP生物合成过程、有氧呼吸和质子跨膜转运等通路也出现显著下调；脂质生物合成过程、膜脂生物合成过程、脂质A和脂多糖生物合成过程以及膜组织等也显著富集，其中ATP合成耦合电子传递的富集倍数为7.15（FDR = 2.34 × 10??）。
**3.3 个体基因变化**
上调基因方面，涉及糖代谢和应激响应通路的基因最为突出。ulaG编码L-抗坏血酸-6-磷酸内酯酶（L-ascorbate-6-phosphate lactonase），在抗坏血酸利用途径中发挥关键作用，其log2FC达到最高的5.68。其次是编码小热休克蛋白（防止变性蛋白聚集）的ibpB基因（log2FC = 5.6）。抗氧化防御系统相关基因中，katG（编码过氧化氢酶-过氧化物酶HPI，参与过氧化氢解毒）显著上调（log2FC = 4.5），烷基过氧化物还原酶对ahpF（log2FC = 3.4）和ahpC（log2FC = 2.0）也同步上调，另有trxC（log2FC = 1.9）升高。热休克蛋白方面，小分子热休克伴侣ibpB（log2FC = 5.6）和ibpA（log2FC = 3.8）以及核心伴侣dnaK（log2FC = 2.2）和dnaJ（log2FC = 1.7）均出现显著上调，可能反映细胞增强了对受损、未折叠蛋白的稳定化能力。抗坏血酸利用系统中，除ulaG外，ulaA、ulaB、ulaD、ulaE以及转录调节因子ulaR（log2FC = 1.6）均呈协同上调。甘油代谢途径同样显著上调，涉及glpD、glpK、glpC、glpQ（log2FC = 1.6）和glpT（log2FC = 1.2），这些基因均为替代碳源利用相关基因。
下调基因方面，冷休克基因cspA、cspE、cspF和cspD显著受抑（log2FC为-4.3至-2.2），表明该冷休克基因家族被广泛抑制。与生物膜形成和卷曲菌毛产生相关的基因（yahO、bdm、csg基因簇）也出现显著下调。渗透压胁迫基因中，osmY（log2FC = -5.0）和osmE（log2FC = -4.4）下调幅度居前，osmX、osmV和osmW也均下调。此外，编码ATP合酶的atpA/B/H/G/E/D/F/I基因簇、呼吸链组分（sdhC/D、nuoA–N、cyoA、cydB）以及中心碳代谢基因（fbaA/B、acs、purB/C/E/F/N、aroA/B/G/K）均出现广泛抑制，提示细胞处于低能量、代谢受限状态。脂多糖（LPS）与O抗原生物合成相关基因簇也显著下调，其中wzzB（log2FC = -4.4）和rfb簇的下调幅度较大，rfaQ、rfaL、rfaP等LPS核心合成相关基因的显著受抑，可能反映外膜完整性的破坏及其免疫逃逸能力的降低。
**3.4 野生型与突变株的敏感性比较**
对五个单基因缺失突变株（ΔkatG、ΔulaR、ΔulaG、ΔulaB、ΔulaE）进行1小时aBL暴露处理，以计算相对于0小时初始菌数和1小时未处理对照的活力降低程度。结果显示，与两个野生型对照菌株相比，各突变株均表现出显著更高的aBL敏感性（p < 0.05），活力降低范围从1.2至2.7 Log CFU/mL不等。其中ΔulaE突变株最为敏感，相对于0小时初始菌数的平均降低值为5.2 Log CFU/mL，相对于1小时未处理对照的降低值为5.7 Log CFU/mL。ΔkatG突变株的平均降低值为4.5 Log CFU/mL，与对照差异显著（p < 0.05）。两个野生型菌株之间的差异极小（小于0.2 Log CFU/mL，p > 0.05）。ΔulaR、ΔulaG和ΔulaB突变株相对于0小时初始菌数的平均降低值分别为5.0、4.4和5.2 Log CFU/mL，相对于1小时未处理对照则分别为5.0、4.2和4.9 Log CFU/mL。
**四、讨论与结论**
讨论部分的总结如下。本研究中katG在405 nm aBL下的选择性上调支持了沙门氏菌过氧化氢酶同工酶存在差异调控的模式，即不同kat基因并非同时响应氧化应激。烷基过氧化物还原酶系统（ahpF/ahpC）和trxC的协同上调与已有关于H?O?暴露的研究一致，提示405 nm aBL可能诱导一种过氧化物型氧化应激。抗坏血酸利用相关基因（ulaG、ulaR等）在无外源抗坏血酸条件下的诱导表明其表达可能受aBL胁迫的非依赖性激活，推测可能通过激活磷酸戊糖途径增强NADPH产生以应对ROS。小热休克蛋白ibpA/ibpB在光氧化条件下的强烈上调支持其不仅参与热应激防御，还参与氧化应激抵抗的假说。生物膜相关基因和表面结构基因的下调提示aBL可能具有预防生物膜形成的潜在应用价值。渗透压保护基因（osmY、osmE等）和能量代谢基因（ATP合酶、呼吸链组分）的广泛抑制反映了aBL处理后细胞处于低能量和渗透保护减弱的代谢受限状态。LPS生物合成基因的部分下调（而非完全缺失）可能通过改变外膜结构和完整性，增强了细胞对aBL的敏感性。
研究结论可归纳为：本研究通过RNA-seq全面解析了鼠伤寒沙门氏菌在405 nm aBL暴露下的全基因组转录响应，揭示了由238个上调基因和1,077个下调基因组成的广泛转录重塑图谱。上调基因以氧化应激防御（katG、ahpC/ahpF）、热休克保护（ibpA/ibpB、dnaK/dnaJ）、抗坏血酸利用和甘油代谢为主要功能类群；下调基因则涉及翻译、能量代谢、生物膜形成、渗透压保护和LPS生物合成等通路。表型实验证实，缺失katG或ula（ulaB/ulaE/ulaG/ulaR）家族基因的突变株对aBL的敏感性显著增强，直接验证了这些基因在aBL耐受中的重要作用。理解aBL对S. Typhimurium的抗菌作用机制，有望为开发以可见光为基础的食品中食源性病原菌净化策略，以及识别能够克服细菌防御响应的关键因子和联合处理（hurdle treatments）方案，从而为提升食品安全水平提供重要的理论依据和技术支撑。
