离子依赖性调控副溶血性弧菌生物膜形成：细胞增殖与胞外基质生产之间的菌株特异性权衡

《Journal of Food Protection》：Ion-dependent regulation of biofilm formation in Vibrio parahaemolyticus: strain-specific trade-offs between cellular proliferation and extracellular matrix production

　　

摘要
副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）的生物膜形成受环境因素调节；然而，离子组成对胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）产生及生物膜结构的影响尚未得到充分表征。本研究考察了一价阳离子（K?）和二价阳离子（Ca2?、Mg2?）单独及组合作用下，环境菌株（菌株5）与临床菌株（菌株8和10）在气-液-壁（air-liquid wall, ALW）界面和浸没（submerged, SM）条件下生物膜的形成情况。研究人员测定了活菌数（log??CFU/cm2）、单位活菌标准化蛋白浓度（nProt）及单位活菌标准化多糖浓度（nPol）。ALW生物膜表现出更高的细胞密度（4.40–6.49 log??CFU/cm2），高于SM生物膜（4.13–6.01 log??CFU/cm2），反映了氧驱动增殖的增强效应。相反，SM条件产生了显著更高的nProt和nPol（p < 0.05），表明低氧环境促进了EPS基质的投资。离子响应具有菌株特异性。牡蛎分离株P5菌株在模拟海水条件下（K?+Ca2?+Mg2?）使nPol/nProt达到最大值。临床菌株P8在K?+Ca2?条件下达到峰值，而大流行菌株P10则偏好单独K?条件。显微镜观察和三维表面图分析显示，ALW界面处生物膜层相对均匀；相比之下，SM生物膜形成了异质性的塔状结构，突出了离子组成和菌株共同导致的结构差异。这些发现表明，阳离子组成和界面条件调节了副溶血性弧菌生长与基质产生之间的平衡。二价阳离子增强结构 cohesión，而一价离子主要支持代谢活性。本研究为离子环境与生物膜结构之间的联系提供了机制框架，并强调了海洋及食品相关环境中菌株特异性响应的重要性。

**离子依赖性调控副溶血性弧菌生物膜形成：细胞增殖与胞外基质生产之间的菌株特异性权衡——论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）是一种革兰氏阴性、嗜盐性海洋细菌，是全球范围内与海产品相关的胃肠炎的主要病原体。该菌天然丰富分布于沿海和河口环境中，并已造成多起与生食或未煮熟贝类相关的暴发事件。近期值得关注的事件包括澳大利亚2021–2022年全国性暴发（主要与生牡蛎相关）以及新西兰2019–2022年与生贻贝相关的多次暴发，涉及ST36和ST50等菌株。副溶血性弧菌的致病性主要由耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin, TDH；由*tdh*编码）和/或TDH相关溶血素（TDH-related hemolysin, TRH；由*trh*编码）的产生所驱动。临床分离株通常携带其中一个或两个基因，尽管在环境菌株中也可检测到这些基因。感染范围从自限性胃肠炎到伤口感染，在免疫功能低下的个体中可发展为危及生命的败血症。

该病原体在环境中持久存在和传播的关键因素是其形成复杂三维生物膜群落的能力，这些生物膜被包裹在主要由多糖、蛋白质和胞外DNA组成的胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质中。EPS基质提供结构完整性、保留营养物质，并赋予对环境胁迫、抗菌剂和宿主免疫反应增强的耐受性，从而使海洋栖息地和食品加工设施中的控制工作复杂化。生物膜发育受到物理化学信号的严格调控，包括温度、pH、营养可用性和无机离子。在海洋环境中，K?、Ca2?和Mg2?等离子浓度较高。二价阳离子（Ca2?和Mg2?）可与带负电的EPS组分结合，通过离子桥接促进基质凝聚力，而一价离子则有助于细胞内渗透平衡和代谢调控。这些离子在食品加工环境中也具有相关性，可能影响设备和海产品表面的生物膜形成。尽管阳离子在细菌黏附和生物膜成熟中的重要性已被公认，但K?、Ca2?和Mg2?对副溶血性弧菌细胞增殖与EPS产生之间平衡的综合及菌株特异性效应仍知之甚少。

副溶血性弧菌种群表现出明显的生态分化，包括环境适应菌株和临床相关谱系，其中包含大流行O3:K6克隆及其衍生株。这表明离子感应和调控网络可能存在差异，这些差异可能影响生物膜结构、EPS组成和适应性。然而，很少有比较研究检验一价和二价阳离子在不同菌株中的效应。本研究旨在探究离子组成是否为EPS基质投资的关键环境调节因子。研究人员评估了环境牡蛎分离株（菌株P5）、临床菌株（菌株P8）和大流行菌株（菌株P10）在K?、Ca2?和Mg2?不同组合下的表现，并在气-液-壁（air-liquid wall, ALW）界面和浸没（submerged, SM）界面评估了生物膜形成。据研究人员所知，这是首次在不同离子条件下量化副溶血性弧菌在ALW-SM界面生物膜中单位活菌标准化蛋白浓度（nProt）和单位活菌标准化多糖浓度（nPol）的研究。

**二、研究开展内容与主要结论**

本研究利用三种副溶血性弧菌菌株——P5（牡蛎分离株，强生物膜形成菌，来源于新西兰植物与食品研究所有限公司）、P8（临床致病性分离株，弱生物膜形成菌，来源于新西兰环境科学研究所）和P10（临床致病性分离株，中等生物膜形成菌，来源于日本大阪大学微生物疾病研究所的Tetsuya Iida博士）——在不锈钢（SS）贴片上评估了离子组成对生物膜形成的影响。研究采用完整的23析因设计，以K?、Ca2?和Mg2?为自变量，每个因子设两个水平（存在或不存在），共产生八种实验条件（含对照），最终离子浓度为10 mM K?、10 mM Ca2?和55 mM Mg2?。将部分浸没的SS贴片（AISI 316级，2B光洁度）置于25 mL相应培养基中，在30°C下孵育24小时，分别从ALW和SM区域取样分析。

研究得出以下主要结论：ALW生物膜表现出更高的细胞密度（4.40–6.49 log??CFU/cm2），高于SM生物膜（4.13–6.01 log??CFU/cm2），反映了氧驱动的增殖增强。相反，SM条件产生了显著更高的nProt和nPol（p < 0.05），表明低氧环境促进了对EPS基质的投资。离子响应具有菌株特异性：牡蛎分离株P5在模拟海水条件（K?+Ca2?+Mg2?）下使nPol/nProt达到最大值；临床菌株P8在K?+Ca2?条件下达到峰值；大流行菌株P10则偏好单独K?条件。显微镜观察和三维表面图分析显示，ALW界面处生物膜层相对均匀，而SM生物膜形成了异质性的塔状结构。这些发现表明，阳离子组成和界面条件调节了副溶血性弧菌生长与基质产生之间的平衡，为理解离子环境与生物膜结构之间的联系提供了机制框架。该论文发表于《Journal of Food Protection》。

**三、主要关键技术方法**

研究人员使用了以下关键实验技术：（1）不锈钢贴片部分浸没培养系统，用于在ALW和SM两个界面同时生成生物膜；（2）活菌计数法（平板涂布计数，以log??CFU/cm2表示）；（3）EPS提取及定量分析，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量、二辛可宁酸（bicinchoninic acid, BCA）法测定蛋白含量，并将结果分别标准化至单位活菌数，即nPol（μg多糖/10?细胞）和nProt（μg蛋白/10?细胞）；（4）吖啶橙和荧光增白剂（Calcofluor White）双荧光染色结合落射荧光显微镜观察及三维表面图分析，用于评估生物膜结构。菌株来源包括新西兰植物与食品研究所有限公司（P5）、新西兰环境科学研究所（P8）及日本大阪大学微生物疾病研究所（P10）。

**四、研究结果**

**4.1 生物膜活菌计数**

**4.1.1 界面依赖性活菌数**
在所有菌株和离子培养基中，ALW界面的活菌数均高于SM界面。对于菌株P5，ALW活菌数超过SM，仅在Mg2?和对照培养基中观察到统计学显著差异（p < 0.05）。菌株P8仅在K?+Ca2?培养基中ALW显著高于SM（p < 0.05），其余培养基无显著差异。菌株P10在K?、K?+Mg2?、Ca2?+Mg2?和对照培养基中ALW显著高于SM。总体而言，ALW界面产生的活菌数高于SM界面，但存在菌株特异性差异。

**4.1.2 离子依赖性活菌数**
在ALW条件下，所有菌株中最高生物膜强度出现在菌株P8的K?+Ca2?+Mg2?联合处理组（6.49 log??CFU/cm2）。菌株P5范围为4.39至5.39 log??CFU/cm2，菌株P10范围为4.40至5.14 log??CFU/cm2。在SM条件下，菌株P5在K?+Mg2?处理组达到最高值（4.49 log??CFU/cm2），在单独K?处理组最低（4.095 log??CFU/cm2）；菌株P8在K?+Ca2?+Mg2?处理组最高（6.01 log??CFU/cm2），在K?+Ca2?处理组最低（4.089 log??CFU/cm2）；菌株P10在K?+Ca2?+Mg2?处理组最高（4.78 log??CFU/cm2），在单独K?处理组最低（4.137 log??CFU/cm2）。

**4.2 单位细胞标准化蛋白和多糖浓度定量**

**4.2.1 界面依赖性产生**
对于所有菌株（P5、P8和P10）及大多数离子培养基，SM界面的标准化多糖（nPol）和蛋白（nProt）浓度显著高于ALW界面（p < 0.05）。SM界面在30°C下的最高nPol为P5菌株1.0 μg/10?细胞、P8菌株0.9 μg/10?细胞和P10菌株0.9 μg/10?细胞。在ALW中，所有温度下标准化多糖产量均保持较低水平（< 0.5 μg/10?细胞）。

**4.2.2 离子依赖性产生**
nPol和nProt水平在不同菌株和离子培养基中有所差异。菌株P5在K?+Ca2?+Mg2?培养基中nPol最高（44.15 μg/10?细胞），在K?+Ca2?培养基中最低（6.79 μg/10?细胞），与大多数其他离子培养基存在显著差异（p < 0.05）。菌株P8在K?+Ca2?培养基中nPol最高（30.90 μg/10?细胞），在相同培养基中最低值出现在K?+Mg2?条件下（0.35 μg/10?细胞）。菌株P10在单独K?条件下nPol显著最高（64.20 μg/10?细胞），为所有菌株中最高值，在K?+Ca2?+Mg2?培养基中最低（5.40 μg/10?细胞；p < 0.05）。nProt的产生趋势与nPol类似，最高和最低值出现在相同离子条件下。

**4.3 显微镜观察和三维表面图**

落射荧光成像表明，阳离子补充显著改变了所有测试菌株生物膜的表面结构和空间组织。Calcofluor White染色的副溶血性弧菌生物膜在界面和培养基之间表现出差异。落射荧光图像显示，ALW生物膜比SM生物膜具有更大的表面覆盖率，而SM生物膜表现出更多异质性结构，在某些情况下具有更高的荧光强度。SM生物膜的三维表面图显示更明亮的荧光和更突出的峰，特别是菌株P5，而ALW生物膜的三维表面图则显示更薄、更均匀的垫状结构。

在K?+Ca2?+Mg2?条件下，菌株P5在ALW界面表现出相对较厚且强烈的荧光模式，Calcofluor White染色也显示相对致密、连续的多糖相关荧光模式，表面覆盖率更大，表明在联合阳离子条件下ALW界面形成了更连续和有组织的生物膜结构。在Ca2?+K?条件下，SM生物膜表现出更明显的异质性结构，在Calcofluor White三维表面图中具有众多突出峰和塔状特征，与其他离子条件相比，SM界面观察到最强荧光峰。在单独K?条件下，菌株P5的SM生物膜与其他菌株和界面相比表现出最大的结构厚度和最明显的荧光峰，三维表面图显示多个突出峰，表明异质性和高度发展的空间结构。总体而言，显微镜观察表明离子组成以菌株和界面依赖性方式影响生物膜结构。

**五、讨论与结论**

本研究表明，离子作为多功能环境线索，不仅调节生物量积累，还调节单位细胞的胞外多糖（nPol）和蛋白（nProt）产生，以及整体生物膜结构。在ALW界面，生物量积累主要由细胞增殖驱动，单位细胞的蛋白和多糖投资较低；而SM条件促进更大的单位细胞基质合成。这种解耦突出了基本权衡：ALW界面以细胞增殖为主，SM条件则促进更大的单位细胞基质合成。这些观察到的差异可能是对两界面间更陡峭的物理化学梯度、减少的氧扩散和增加的附着需求的适应性响应。

阳离子补充揭示了生长和nPol/nProt投资中高度菌株特异性的模式。环境菌株P5在含K?+Ca2?+Mg2?的海水样条件下达到nPol和nProt最大值，这种协同响应可能源于二价阳离子桥接带负电EPS组分，增强基质凝聚力和机械强度，结合K?介导的渗透稳态和代谢效率支持。临床菌株P8在K?+Ca2?条件下表现出最强的nPol和nProt产生，表明更特化的离子感应机制适应较窄的环境窗口。菌株P10在单独K?条件下nPol最高，Ca2?或Mg2?的添加抑制了nPol和nProt合成，尽管支持ALW中的强劲生长，表明存在特化的K?依赖性EPS生物合成途径，对二价阳离子干扰敏感。

菌株特异性响应应在所检查的单个分离株背景下解释，而非作为环境和临床副溶血性弧菌种群之间的代表性差异。菌株P5是分离自牡蛎的环境菌株，P8是与新西兰近期暴发相关的临床菌株ST50，P10是临床菌株（RIMD2210633，自1996年以来引起全球暴发的大流行克隆O3:K6/ST36）。牡蛎分离株似乎优化用于在波动的海洋和河口栖息地中持久存在，其中混合离子条件促进稳健的nPol和nProt基质，有助于附着贝类表面和抵抗环境胁迫。临床和大流行菌株则表现出较窄的离子偏好，可能有利于人类胃肠道中的快速定殖。

从应用角度看，本研究中观察到的离子依赖性响应可能与海洋和海产品加工环境相关，其中副溶血性弧菌会遇到海水来源或含离子的工艺水。在不锈钢食品接触表面上，局部离子环境的变化可能影响生物膜发育和基质特性。富含EPS的SM生物膜即使活性降低也可能表现出更大的结构稳健性和持久性，特别是在离子丰富的环境中，升高的阳离子浓度可增强基质稳定性和生物膜持久性。相反，在ALW界面形成的高密度、低nPol和nProt生物膜可能尽管细胞数量多，但更容易受到机械或化学破坏。SM生物膜可能构成风险，因为它们在低氧环境中支持长期存活，如贝类组织、沉积物或充满水的设备，其中单位细胞具有更高的EPS含量。

总之，离子组成是副溶血性弧菌生物膜中EPS基质投资和细胞增殖的关键调节因子。这种调节具有菌株特异性、界面依赖性，并由反映病原体特征的协同和拮抗阳离子相互作用所塑造。通过将海水样离子线索与生物膜结构和EPS动态联系起来，本研究为理解EPS中的生态位分化提供了机制框架，并为改善海洋和食品工业环境中的生物膜缓解策略提供了实用见解。

**研究结论**：离子组成是副溶血性弧菌生物膜中EPS基质投资和细胞增殖的关键调节因子，这种调节具有菌株特异性、界面依赖性，并由协同和拮抗的阳离子相互作用所塑造。通过将海水样离子线索与生物膜结构和EPS动态联系起来，本研究为理解EPS中的生态位分化提供了机制框架，并为改善海洋和食品工业环境中的生物膜缓解策略提供了实用见解。