脾内胸腺器官发生来自可注射组织碎片恢复功能性T细胞免疫

《Advanced Science》：Intrasplenic Thymus Organogenesis from Injectable Tissue Fragments Restores Functional T-Cell Immunity

　　

由原发性缺陷、衰老、感染或细胞减少治疗引起的胸腺功能减退导致T细胞受体（TCR）库的严重受限，并增加发病率和死亡率。因此，恢复胸腺功能至关重要。在此，脾脏内独特的生态位启发了脾内胸腺再生（ISTR）的发展，这是一种将培养的胸腺组织碎片植入无胸腺裸鼠、老年小鼠、接受造血干细胞移植（HSCT）的胸腺切除小鼠以及人源化小鼠脾脏的方法。脾脏丰富的血管系统和支持性基质环境使得快速胸腺器官发生成为可能，从而重建表型多样且功能性的T细胞区室，以及对病毒和肿瘤挑战的保护性反应。与肌肉内植入相比，ISTR驱动更快且更完全的胸腺发育，产生更大的T细胞输出，并且与较低的移植物抗宿主病发生率相关。在人源化动物中，脾内胸腺移植物也促进功能性人T细胞的快速出现。这些结果确定脾脏是胸腺再生的最佳异位生态位，并为临床免疫重建和再生免疫学提供了一种有前景的策略。

**研究背景与问题**
胸腺是T细胞发育和免疫耐受建立的核心淋巴器官，但其极易因原发性缺陷、衰老、感染、细胞减少治疗及胸腺切除等因素导致功能减退或萎缩，造成T细胞受体（TCR）库严重受限，增加感染、肿瘤及自身免疫风险。现有治疗策略（如激素调节、细胞因子、细胞治疗及组织工程）在胸腺完全缺失或不可逆损伤时效果有限，且传统肌肉内胸腺移植（IMTI）免疫重建缓慢且不完全，移植物抗宿主病（GVHD）风险较高。因此，亟需开发更高效、安全的胸腺再生策略。

**研究的开展与结论**
研究人员受脾脏独特的血管丰富、基质支持及免疫调控微环境启发，提出脾内胸腺再生（ISTR）策略：将体外培养的新生小鼠胸腺组织碎片注射至无胸腺裸鼠、老年小鼠、胸腺切除后接受造血干细胞移植（HSCT）小鼠及人源化小鼠的脾实质内。结果显示，ISTR在多种模型下均能驱动快速、完整的胸腺器官发生，重建表型多样、功能成熟的T细胞区室，恢复抗病毒和抗肿瘤免疫，且GVHD发生率显著低于IMTI。在人源化模型中，ISTR同样促进功能性人T细胞的快速产生。该研究确定脾脏是胸腺再生的最佳异位生态位，为临床免疫重建和再生免疫学提供了新策略。论文发表在《Advanced Science》。

**关键技术方法**
主要方法包括：①体外培养胸腺组织（培养≥6天以去除供体胸腺细胞，保留上皮细胞富集的基质）；②脾内注射（20-G针头，碎片大小约0.7 mm）；③流式细胞术分析T细胞亚群及胸腺细胞分化；④TCR β链测序（ImmuHub系统，5' RACE扩增，Illumina NovaSeq平台）评估TCR库多样性；⑤病毒挑战（VSV-GFP和LCMV Armstrong株）和肿瘤移植（B16黑色素瘤、HCT116结肠癌）评估免疫功能；⑥人源化小鼠模型（NCG-X小鼠，移植同源胎儿胸腺组织及CD34⁺造血干细胞）。样本来源包括C57BL/6J-EGFP、BALB/c、BALB/c裸鼠、老年C57BL/6J小鼠及人源化NCG-X小鼠，人体样本来自胎儿肝脏（经伦理批准）。

**研究结果**
2.1 Efficient Ectopic Thymus Regeneration in the Spleen：通过组织学、免疫荧光及转录组分析，证明ISTR移植物在第2周已形成清晰的皮质-髓质结构，第8周大小达天然胸腺的~50%，而IMTI移植物<10%；脾脏微环境富含胸腺生成因子（如Ptma、Ltb、Flt3l）及淋巴样祖细胞（CLP），促进胸腺发育。

2.2 T-Cell Reconstitution in ISTR Mice：流式细胞术追踪显示，ISTR小鼠外周血CD3⁺T细胞在2周后出现，8周达BALB/c水平的~50%，CD4/CD8比值正常，幼稚T细胞（CD62L⁺CD44^-）及调节性T细胞（FoxP3⁺）重建良好，TREC定量证实T细胞为胸腺新生来源。

2.3 T-Cell Receptor Repertoire Diversity and GVHD Assessment in ISTR Mice：TCR β链测序显示ISTR小鼠CD4⁺T细胞V-J配对分布、CDR3长度及多样性指数（Shannon、Pielou等）与BALB/c小鼠无显著差异；GVHD评分、血清细胞因子及组织病理学评估表明ISTR组GVHD发生率及严重程度显著低于IMTI组，长期观察（10个月）显示轻度免疫适应但无严重GVHD。

2.4 T-Cell Reconstitution of ISTR in Aged Mice and HSCT Mice：在20月龄老年小鼠中，ISTR组幼稚T细胞计数升高、KLRG1⁺衰老T细胞比例下降；在胸腺切除+致死照射+HSCT模型中，ISTR联合T细胞去除的HSC输注（Thx.IRR.TCD-HSC.ISTR）使外周T细胞从第2周开始恢复，第8周绝对数显著高于IMTI组，脾组织恢复更完整。

2.5 Restoration of Antiviral and Antitumor Immunity Following T-Cell Reconstitution：VSV感染后24小时，ISTR小鼠CD4⁺和CD8⁺T细胞CD69上调，第10天脾脏指数恢复正常，组织病毒清除（GFP成像减少，VSV-G免疫荧光减弱）；LCMV感染后第12天，ISTR小鼠脾、肝、肾、脑中病毒RNA载量显著低于裸鼠。B16肿瘤移植后，ISTR小鼠肿瘤体积显著缩小，肿瘤内CD3⁺和CD8⁺T细胞浸润；HCT116异种移植后ISTR小鼠肿瘤形成率为0%。

2.6 Assessment of Graft Resilience and Durability：亚致死照射（3 Gy）后，ISTR移植物在14天时胸腺细胞总数显著反弹，而IMTI无恢复；二次移植实验中，ISTR-ISTR组脾T细胞比例及移植物大小均优于IMTI-IMTI组，表明ISTR移植物具有更强的辐射耐受性和组织稳定性。

2.7 Enhancement of Human T-Cell Repopulation via ISTR：在人源化NCG-X小鼠中，IST联合HSC移植（HSC+IST）组在13周时外周血人CD3⁺T细胞数量及比例显著高于HSC+IMT组，CD4⁺和CD8⁺T细胞计数更高，幼稚T细胞（hCD45RA⁺hCD62L⁺）绝对数增加，且CD4⁺T细胞可分化为Th1、Th2、Th17、Treg亚群。

**讨论总结**
讨论部分指出，ISTR的成功归因于脾脏独特的微环境，包括：窦状血管系统允许早期灌注、疏松基质减少机械压迫、高血管可塑性促进快速重建、以及驻留免疫细胞提供的再生信号。在安全性方面，ISTR小鼠GVHD发生率低，源于脾内自身抗原递呈促进中枢耐受、以及脾脏耐受性抗原递呈细胞（APC）诱导的自身耐受。ISTR对先天性胸腺发育不全、严重感染后免疫重建及移植耐受诱导具有重要临床潜力，并可作为研究胸腺结构与中枢耐受的工具。

**研究结论翻译**
在本研究中，研究人员建立了ISTR策略，并在胸腺发育不全、胸腺退化及胸腺切除小鼠模型以及人源化小鼠模型中表征了其在胸腺生长和T细胞输出方面的效力。研究结果表明，在多种实验条件下，ISTR在支持组织发育和产生多样化T细胞群体方面优于IMTI。这一能力对于维持胸腺功能障碍时的完整免疫功能至关重要。这些发现强调了ISTR在胸腺再生和T细胞重建中的潜力，并推动进一步探索调控多样化T细胞群体产生和中枢耐受的方法。