《Immunological Reviews》：The Influenza-Specific Immunoglobulin Repertoire – Nimble Yet Steeped in Tradition
流感病毒已在人类群体中流行并与我们共同进化了数百年甚至更久，通过持续的宿主-病毒军备竞赛塑造了我们的免疫组库。在不同个体之间，抗体反复趋同于捕获这种易变病毒的共享解决方案，通过直接由种系免疫球蛋白基因编码的结构特征，精确靶向保守的易感位点——这些位点是病毒无法在不付出功能代价的情况下改变的。这些反复出现的公共抗体，被称为多供者类抗体，对于理解人类抗流感免疫以及指导可能改变宿主-病毒军备竞赛平衡的疫苗策略至关重要。随着单细胞生物学、结构生物学和计算方法的成熟，我们免疫组库中以前未探索的领域逐渐显现。在此，我们回顾了当前对流感特异性免疫组库的理解，重点聚焦于靶向病毒血凝素和神经氨酸酶（保护性抗体的两个主要靶点）上抗原超位点的抗体和多供者抗体类别，并讨论这些见解如何推动变革性流感疫苗的开发。
**1 引言**
流感病毒具有负义单链RNA基因组，由8个不同的基因组片段组成，编码10种主要蛋白质。其中两种是病毒表面的糖蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），它们是保护性B细胞反应的主要靶点，也是本综述的重点。流感感染通过HA头部上的受体结合位点（RBS）与唾液酸化宿主细胞受体结合并介导内吞作用。内体酸化后，HA发生构象变化，介导病毒与内体膜融合并释放病毒基因组。在宿主细胞中合成病毒蛋白后，新形成的病毒粒子被输出到细胞表面。HA从细胞表面脱离和病毒粒子释放由病毒唾液酸酶NA介导。因此，阻断HA和NA的抗体分别抑制病毒生命周期。HA分子是一个同源三聚体，由两个主要功能区域组成：包含RBS的球形头部和容纳病毒融合机制的茎部或柄部。流感HA在系统发育上可分为A型和B型。在A型中，多种HA进一步分为抗原性不同的第1组和第2组。目前人类群体中每种类型各有一个亚型共同流行：H1（第1组）和H3（第2组）。类似地，NA在A型内也分为第1组和第2组，目前流行的人类病毒中仅有N1（第1组）和N2（第2组）。在每个亚型内，持续发生抗原漂移，导致新毒株的出现。大多数抗原变化发生在HA头部区域，特别是围绕RBS的区域，由抗体驱动的逃逸突变介导。相比之下，HA茎部在亚型内和亚型间相对保守，是广泛中和抗体反应的主要靶点。
**2 HA特异性组库的趋同**
B细胞组库是个体内独特抗原受体的总多样性集合。在群体水平上，对HA特异性组库的研究揭示，尽管人类免疫球蛋白（Ig）组库具有惊人的多样性，但表位特异性反应在个体间表现出免疫遗传趋同性。如同对其他病毒的反应所见，靶向相同流感HA表位的抗体富集了特定的Ig重链和轻链基因以及互补决定区（CDR）序列。这种分子趋同可以表现为特定的可变重链和轻链（VH和VL）基因对加上具有特定氨基酸（aa）基序的CDRH3序列，或者更松散地定义为优先使用特定VH或VL基因或CDR中对结合特定表位至关重要的特定残基。在本综述中，我们将这些以共享分子特征结合表位的趋同模式称为多供者类。值得注意的是，共享可变基因使用并不一定等同于以相同方式结合表位，下文将详细描述，因此识别特定类别可能很困难。在同一个体内，通常存在属于同一多供者类、结合相同表位的多个克隆谱系，表明在同一个体内从初始B细胞组库中发生了多次分子趋同[1-3]。遗传因素和特定的流感暴露可能在塑造趋同反应中发挥作用。随着单细胞测序方法的不断改进和抗原特异性B细胞组库数据库的增长，个体内和群体内可能会出现更多分子趋同的例子。
**2.1 HA头部特异性组库的趋同**
多年来已描述了多种结合HA头部表位的多供者类，既包括广泛交叉反应的，也包括窄特异性的。有趣的是，大多数是在首次接触新型HA后被识别的。例如，首次接触2009年大流行H1N1病毒富集了罕见的抗体类别。三个研究组独立鉴定出表达VH3-7与JH6配对、具有18个氨基酸长CDRH3且含有共同基序的BCR谱系，该基序结合HA头部上的Sa抗原位点[2-4]。这一类在通过感染或疫苗接种首次对2009年大流行H1N1毒株作出反应的个体中扩增，但在后续对大流行H1N1的反应中未观察到，表明在存在新产生的2009年大流行H1N1特异性B细胞的情况下，这可能是一种亚显性反应[2-4]。在2009年H1N1疫苗接种后的多个个体中也鉴定出结合HA头部侧向补丁的抗体，其VH和VK基因使用受限，通常为VH3-23和VK1-33，CDRH3中含有YXR（其中X可为任意aa）基序[5]。在接种2009年H1N1疫苗的个体中鉴定的另一类别以VH2-70和DH4-17为特征，通常与VL3-21或VL3-9配对。该类别中的CDRH3延伸至RBS，并主要通过YGD基序与口袋结合[6-9]。其他具有多样可变基因使用的RBS特异性抗体也被证明通过CDRH3中的中心Asp残基与口袋结合[10]，表明存在结合RBS的常见分子策略。CDRH3的Asp模拟唾液酸与HA的羧酸相互作用，而通常紧接Asp之前的Val残基模拟唾液酸的乙酰氨基相互作用，尽管该特征在抗体间并不一致[10]。HA三聚体界面已被鉴定为具有规范特征的广泛结合抗体的靶点[11, 12]。结合该表位的抗体使用多样的VH基因，但共享VK1-39基因使用。CDRH3中的酸性残基（Asp或Glu）以及VK1-39的规范CDRL2对于结合该表位至关重要[11]。
多供者类也可以在首次接触新型HA亚型时从初始B细胞组库的从头反应中检测到。在既往无H2暴露的个体中对H2疫苗接种的反应中，在多个个体中检测到三个独立的多供者类，每个类具有独特的VH和VK基因配对和规范CDRH3，结合三个不同的HA头部表位[13]。此外，在五名接种H5免疫原的个体中鉴定出一类具有跨H5分支广泛中和能力的H5特异性抗体[14]。该类别以VK2-28编码的轻链为特征，CDRL1和CDRL2中含有种系编码的残基，这些残基是结合跨H5亚型保守的侧向表位的关键接触点[14]。因此，多供者类同时存在于记忆和初始B细胞组库中，并且可以在对流感感染或疫苗接种的回忆反应和从头反应中作出响应。
**2.2 HA茎部特异性组库的趋同**
与具有许多抗原位点的HA头部不同，结合HA茎部的抗体在人组库中主要局限于两个主要区域[15, 16]。一个围绕茎部中心附近的疏水沟，称为中央表位，另一个朝向HA胞外域的基部，称为锚定或下部表位。中央表位高度保守，是能够结合并中和第1组或第2组内或两组间亚型的广泛中和抗体的靶点。结合HA茎部下部的抗体通常具有亚型特异性，但在亚型内的广度仍大于大多数靶向头部的抗体。结合HA茎部的抗体一个显著特征是无论在个体内还是群体中，其组库都受限。在对第1组免疫原的疫苗接种反应中，两项疫苗研究中的40/40个体鉴定出多供者类，占其茎部特异性组库的60%至98%[1, 15]。对第2组免疫原的反应更加多样，但在两项疫苗研究中的33/41个体中仍鉴定出多供者类，占其组库的1%至60%[1, 16]。
已描述了五个主要的多供者类结合中央表位（图1）。最大且最普遍的是VH1-69类，在我们用第1组免疫原（包括H1稳定茎、H5或H2 HA）免疫的所有个体中均被鉴定到[1, 15, 17]。在对第2组免疫原的反应中，定义为VH1-18且含有QXXV CDRH3基序的类别最普遍，在约60%的疫苗接种个体中发现[1, 16]。由VH1-18编码且具有ILTG CDRH3基序或VH6-1与DH3-3编码的IFGV/I CDRH3基序的其他类别也已被鉴定，但不太普遍[18]。结构上，后一类使用DH3-3编码的IFGV/I基序接触Trp21HA2疏水沟，VH6-1编码的CDRH2提供补充相互作用[18, 19]。除了这些类别外，DH3-3带有IFGV/I基序或DH3-9作为ILTG或LXYFXWL（取决于阅读框）是一种独立于VH基因使用、通过CDRH3结合茎部疏水沟的重复策略（图1）[7, 20]。某些VH基因，如VH3-30，在茎部结合抗体中也富集，但对由该VH基因编码的抗体的结构分析表明存在多种结合模式，目前尚不清楚驱动该VH基因偏好的原因[17, 21]。
图1 不同的多供者类靶向HA茎部。对于每个多供者类，指示了结合HA茎部的核心基序、每个类的主要流感特异性以及通常通过体细胞超突变实现的广度水平。
尽管高度保守，但第1组和第2组HA亚型的中央茎部区域在糖基化模式和相对于HA头部的方向上均有所不同。因此，每个多供者类基于其结合模式，其通常实现的交叉反应水平不同。VH1-69类主要通过其种系编码的CDRH2二肽Ile-Phe（IF）基序结合围绕Trp21HA2的中央茎部疏水沟，并且需要有限数量的体细胞超突变即可实现高亲和力结合[22]。然而，除了少数显著例外[23, 24]，VH1-69类抗体仅结合并中和第1组亚型，主要原因是无法容纳大多数第2组亚型上存在的38HA2位点聚糖[23]。有趣的是，当在表达人VH1-69基因的转基因小鼠中，将全部内源小鼠DH和JH基因替换为人DH和JH基因时[25]，其对HA茎部的B细胞反应可以从VH1-69介导的识别转变为DH3-9依赖性结合，取决于免疫HA茎部的特征[26]。当用支持规范CDRH2介导的VH1-69识别的第1组茎部免疫时，它们产生人样VH1-69依赖性B细胞反应[25-27]。然而，当用与规范VH1-69识别不相容的第2组茎部免疫时，同一小鼠转变为CDRH3介导的LXYFXWL基序依赖性识别[20]。这种转换主要由第1组和第2组HA茎部的改变糖基化模式决定[26]。尽管这些发现具有有限的转化或临床相关性，但它们提示了通过选择性抗原设计重定向异常免疫反应的策略。
VH1-18 ILTG和VH6-1 + DH3-3类也表现出跨第1组亚型的广泛广度和强效中和能力，可能源自对H1 HA反应的初始前体。然而，有许多例子表明这两个类别通过体细胞超突变获得了对第2组亚型的广度[1, 28]。对这些类别从第1组特异性到跨组特异性的成熟过程分析表明，这是一个多方面的过程，涉及重链和轻链上的突变[29]。VH6-1 + DH3-3类，包括MEDI8852和56.a.09[18, 19]，代表了最广泛和最有效的茎部导向多供者类之一，尽管仅在部分个体中鉴定到[1, 15, 18, 19]。
与讨论的其他三类不同，VH1-18 QXXV类首先由第2组亚型激发，然后获得对第1组亚型的交叉反应性。发现CDRH2中的N55T突变足以获得对第1组亚型的结合能力，但需要额外突变才能获得中和第1组亚型的能力[30]。人群体中发现的许多VH1-18 QXXV谱系只能中和第2组亚型[1, 28, 31]。
结合第1组亚型上锚定茎部表位的抗体也极其规范地定义为主要由VH3-23/VH3-30/VH3-48与VK3-15/VK3-11配对，CDRL3中含有种系编码的NWP基序（图1）。CDRL3与CDRH2的Tyr58一起作为与HA融合肽的主要接触点[15, 32, 33]。在结合锚定茎部表位的抗体组库调查中，该类在19/20个体中被鉴定到，代表结合该抗原位点的大多数抗体。由于尚未完全理解的原因，这类抗体主要限于结合H1 HA，仅偶尔结合其他第1组亚型H5和H2[15, 32]。与结合第1组锚定表位的抗体相反，结合第2组亚型下部茎部抗原位点的抗体组库相当多样，没有明确的多供者类[16]。靶向该第2组表位的抗体也主要限于结合第2组内的H3和H10毒株[16]。尽管该区域相当保守，但亚型间和H3毒株间的残基差异导致抗体的交叉反应性和效力不同[16, 34]。
总之，靶向HA茎部的抗体组库的强分子趋同为设计能够特异性结合这些广泛中和且普遍存在的抗体类别前体的免疫原提供了独特机会。
**2.3 HA特异性组库的种间保守性**
非人灵长类，特别是猕猴，几十年来一直是生物医学研究的核心，因为它们与人类的进化接近性。人类和黑猩猩在600-900万年前有共同祖先，而猕猴在超过2500万年前与人类分化[35]。因此，它们的免疫组库（包括Ig种系基因）在数百万年中独立进化以对抗传染性和非传染性威胁，仅由生存压力驱动。尽管流感病毒或其他人类病原体可能对这些物种或其他实验动物模型（如啮齿动物）的免疫组库塑造几乎没有或没有选择压力，但它们的免疫系统在对病毒蛋白的某些结构特征作出反应时表现出惊人的趋同性。
1993年，小鼠单克隆抗体C179被报道为第一个跨H1和H2亚型的广泛中和HA茎部导向抗体[36]。二十年后，C179的结构被解析[37]，揭示其与上述含DH3-9编码的LXYFXWL基序的人类HA茎部表位抗体惊人相似[20]。人类这类抗体（如FI6v3[38]）的核心YFXW基序做出的关键接触几乎被鼠C179 CDRH3中的YFXY基序完美复制[37]。尽管LXYFXWL基序在人类中由种系DH3-9基因编码，但小鼠种系DH基因中缺乏相同基序，表明VDJ连接中YFXY基序的随机性，这可能解释了为何此类广泛中和抗体在该物种中罕见。
猕猴Ig组库与人类既有差异也有相似之处[39, 40]。许多人类VH基因直系同源物存在于猕猴中，具有不同程度的序列同源性。例如，猕猴VH1-69直系同源物VH1-138具有高度序列同源性和特征性疏水CDRH2尖端，但缺乏对人类规范HA茎识别至关重要的关键IF二肽[22]。因此，长期以来假设猕猴不能通过VH1-138以人类方式介导HA茎识别。然而，最近数据显示猕猴确实优先使用VH1-138用于HA茎特异性B细胞[41]。与人类VH1-69一样，猕猴VH1-138对茎部的识别几乎完全依赖抗体重链接触。尽管具体CDRH2相互作用不同，但两者都使用其疏水CDRH2尖端进入HA茎部Trp21HA2周围的同一疏水沟。VH1-138不仅复制了CDRH2的疏水接触，还复制了CDRH1和中央定位的CDRH3酪氨酸的相互作用，与人类对应物相同。
其他人类多供者类也被猕猴复制，包括人类VH6-1 + DH3-3类。值得注意的是，虽然猕猴缺乏VH6-1基因，但它们拥有与人类DH3-3基因几乎相同的猕猴DH3-41基因[39]。因此，猕猴反复产生携带IFGV/I的抗体识别HA茎部，代表猕猴多供者类，尽管特异性通常限于第1组HA[42]。此外，后来从免疫猕猴中分离出广泛中和抗体789-203-3C12，其跨组广度和效力接近人类VH6-1 + DH3-3类抗体[43]。该抗体利用DH3-41编码的IFGV基序，但来源于与该多供者类不同的VH基因家族。789-203-3C12的IFGV基序与人类56.a.09的精确对齐，说明了病毒易感位点种间趋同的另一个例子[43]。尽管尚不确定，但这种识别模式可能更普遍，因为对猕猴血清的EMPEM分析在免疫后检测到此类抗体反应[41, 44]。
人类靶向HA茎部锚定表位的多供者类（VH3-23/VH3-30/VH3-48基因和CDRL3 NWP基序）也在猕猴中复制。这些茎部锚定导向B细胞在人类中由季节性流感疫苗、嵌合HA疫苗和HA茎部纳米颗粒激发[15, 32]。用相同HA茎部纳米颗粒免疫的猕猴忠实地复制了茎部锚定表位特异性B细胞反应，包括人类多供者类的免疫遗传和结构特征[41]。猕猴使用人类VH3-23或VH3-48直系同源物与人类VK3-15直系同源物配对，精确携带CDRL3 NWP基序[41]。猕猴锚定抗体T009-3E04与HA结合的结构与其人类同源物无法区分。这表明猕猴（以及可能其他非人灵长类物种）能够引发与人类在原子分辨率上趋同的流感HA“公共”B细胞反应。这种表位识别的原子级一致性远远超出了先前对跨物种HA识别的理解，无论是人类与小鼠之间[45]还是与进化上遥远的七鳃鳗之间[46]。虽然人类与猕猴之间还有其他针对病毒靶标的抗体趋同例子，包括人类丙型肝炎病毒[47]和HIV-1[48, 49]，但这些不在本综述范围内，此处不予讨论。
**3 非HA靶向组库**
**3.1 神经氨酸酶**
NA的晶体结构于1983年解析，揭示了同源四聚体组装和每个原体上水解唾液酸苷的催化位点[50, 51]。人单克隆抗体靶向三个主要抗原表面：催化中心及其附近、垂直于四聚体轴的侧面，以及面向病毒膜的底面或暗面[52]。其他潜在抗原位点包括四重对称轴孔、四聚体界面和连接球形头部结构域和病毒膜的茎部。最具广泛交叉反应性的抗体靶向催化位点，直接与底物竞争并抑制唾液酸酶活性[53-55]。侧面和底面抗体通常显示较窄的交叉反应性，限于亚型内广度，并通过间接空间位阻抑制唾液酸酶活性[56-58]。靶向四重轴孔、四聚体界面或茎部的抗体也可能抑制唾液酸酶活性并显示交叉反应性，但需要更多例子来绘制NA的完整抗原景观。对NA抗原景观的理解仍存在空白，对识别NA的B细胞组库的特征描述相对较少。接种当前许可的流感疫苗后对NA的反应极微，可能是由于NA含量低和/或质量差[59]，使得研究人类B细胞反应困难。然而，流感病毒感染在人类中触发强烈的NA导向浆母细胞反应[59]，暴露了当前疫苗设计的关键差距。mRNA-LNP等新疫苗平台可能规避NA的免疫原性挑战。早期临床试验结果显示有前景的NA导向血清抗体反应，表明基于NA的疫苗在适当递送和呈递时，能够结合由既往流感暴露建立的B细胞组库[60]。
尽管NA特异性BCR序列近年来呈指数增长，但仍远少于HA特异性序列。因此，对NA导向抗体的多供者类或纵向谱系追踪的特征描述很少。尽管存在这些限制，来自无关个体的催化位点广泛交叉反应抗体在模拟唾液酸与催化口袋的原子相互作用方面表现出惊人的结构趋同[54, 61-64]。这种模拟通过CDR H3环中的二肽基序——Asp-Arg或Arg-Asp（DR或RD）实现。Asp的羧基模拟唾液酸的羧酸根，而Arg的胍基替代乙酰氨基相互作用[62]。在罕见情况下，Glu替代Asp实现羧酸根模拟，例如人抗体NA-45[65]。显著例外是1G01[53]，它无需精确唾液酸模拟即可实现跨NA亚型（包括B型流感病毒）的广泛广度和效力。尽管如此，保守的CDR H3结构基序介导羧酸根和乙酰氨基模拟仍是大多数人类NA催化位点抗体的标志。DR或RD基序通常位于中央位置，源自非模板化的DH-DJ连接，而非种系DH或JH序列[62]。这些抗体通常具有延长的CDRH3环（18个以上残基），将DR/RD基序投射到催化口袋中。值得注意的是，选择标准与上述靶向HA RBS口袋的抗体相似。与NA催化位点抗体类似，诱变实验表明Glu可替代Asp模拟羧酸根相互作用，证明基序的灵活性[10]。
理论上，HA RBS抗体的前体频率估计为1/30,000，若不考虑中枢B细胞耐受和相容轻链配对，仅考虑长度为18-20个残基的CDRH3且尖端具有疏水残基后接Asp[10]。最近，Jo等人使用来自多个个体的现有超深度测序数据[66, 67]，经验性地计算了NA催化位点抗体的前体频率[62]。仅使用CDRH3标准（19-30个残基长，尖端具有DR或RD基序），他们计算出约1/500的频率，但作者承认这可能是巨大高估[62]。应用更严格的标准，包括DH基因使用和精确DR/RD定位，将频率降低至每百万0-14个，取决于供体和参考抗体[62]。尽管大多数HA RBS和NA催化位点抗体使用JH6基因，但这种优先基因使用与CDRH3长度相关而非功能选择[67-69]。重要的是，HA RBS和NA催化位点导向的B细胞在多个个体中反复出现，具有几乎相同的CDRH3结构基序。尽管基序并非种系编码，但这种趋同表明我们的免疫组库反复发现靶向病毒脆弱性的相同解决方案。这提出了一个可能性，即单一抗体可通过唾液酸模拟同时识别HA RBS和NA催化位点。虽然HA和NA唾液酸结合口袋的化学和结构环境差异使这种可能性不大，但此类抗体理论上可抑制病毒附着和释放，这是病毒生命周期中空间和时间上分离的两个步骤。
**3.2 其他病毒蛋白**
靶向非HA/NA蛋白的免疫组库仍鲜有特征描述。一项研究浆母细胞反应的研究发现，疫苗接种和感染引发的浆母细胞靶向截然不同的病毒靶点[70]。肌内疫苗将浆母细胞反应偏向HA（约90%），而流感感染（无论感染病毒亚型如何）引发更弥散的反应，40%-50%靶向非HA/NA蛋白，包括约20%靶向病毒核蛋白（NP）[70]。然而，该研究未分析这些浆母细胞中的Ig基因使用或鉴定公共克隆型。一项互补研究使用荧光标记的重组NP探针表征了健康人类受试者的NP特异性记忆B细胞[71]。有点出乎意料的是，在20名健康个体中，NP特异性IgG+记忆B细胞在稳态下与HA特异性B细胞一样普遍[71]，表明这些NP特异性B细胞由反复感染激发并维持。对来自三个个体的NP特异性B细胞（约150个序列）的BCR测序显示没有偏倚的基因使用或重复序列基序。NP特异性抗体在体外缺乏病毒中和活性，在小鼠中保护效力甚微，尽管代表了感染诱导B细胞反应的很大比例[70, 71]。它们可能作为免疫诱饵或干扰表位（“distractopes”），与生产性和保护性抗体靶点竞争。
M2胞外域（M2e）是一种小型跨膜离子通道，是保护性抗体的另一个靶点[72-75]。尽管感染或疫苗接种后对M2e的B细胞反应罕见，但分离人单克隆抗体的努力已产生多种抗体，包括临床评估的抗体TCN-032[74]。在该研究中，从23名M2e血清阳性个体（他们筛选的140名受试者中）中的五名的IgG+记忆B细胞产生了M2e特异性抗体。有趣的是，所有15种恢复的抗体均使用单一VK基因VK1-39，尽管该观察受限于小样本量，且缺乏支持分子趋同的结构或序列证据。主要人抗体TCN-032在2期临床试验中测试了抗流感效力，但未达到主要终点，尽管在实验性感染后显示出减轻症状的弱信号[76]。
**4 流感特异性组库的纵向分析**
大多数个体在生命的最初2-3年内首次暴露于流感并建立流感特异性免疫组库，随后在终生中通过感染或疫苗接种的后续流感暴露而演变。组库随时间变化的程度尚不清楚，因为缺乏多年的全面纵向研究，但不同年龄组流感组库的研究表明，早期反应更多样化，在晚年变得更寡克隆，可能由于持续流感暴露和免疫衰老加剧[77]。与此一致，一项研究还发现老年人流感特异性克隆内的突变多样性较少[78]。H2N2仅在1957年至1968年间在人类群体中流行，为观察童年时期产生且无后续H2N2暴露的H2特异性组库提供了机会。一项使用基于出生年份的队列（有或无H2既往暴露）研究2018年H2疫苗接种反应的研究表明，童年感染产生的记忆B细胞终生维持在记忆B细胞组库中，并在50年后对H2疫苗作出反应，很大程度上排除了从头B细胞反应[13]。此外，这些长寿命记忆B细胞比1968年后出生个体对新疫苗产生的新记忆B细胞更寡克隆、多样性更低[13]。在观察天花疫苗接种后40多年产生的长寿命天花B细胞组库时观察到类似现象[79]。这表明随着时间的推移，某些HA特异性克隆型在长期存活方面具有竞争优势，即使在无抗原暴露的情况下，个体内抗原特异性组库也变得更不多样化。另一项研究分析了一名成年人10年期间识别保守HA茎部表位的两条广泛中和谱系[80]。这些谱系在该时期持续检测到，并多年对含有不同HA亚型的多种流感疫苗作出反应。然而，几乎没有证据表明这些谱系在该时期内进一步成熟或进化[80]。用不同HA疫苗接种扩增了谱系系统发育的不同分支，但未驱动可检测的渐进成熟。总之，这些研究描绘了一幅图景：生命早期建立的B细胞组库得以维持并继续对抗原暴露作出反应，但在初始成熟后随时间变化很小。
**5 组库的决定因素**
**5.1 遗传学**
尽管在个体中经常检测到多供者类，但这些类内及其外部的分子多样性因人而异[1, 15]。V基因等位基因多态性在组库中丰富，并在决定HA特异性组库中发挥重要作用。一项研究检查了超过1000个已发表的抗原-抗体结构，确定V基因等位基因多态性可在52%的抗体互补位中发现，在许多情况下，替代等位基因会破坏相互作用[81]。确实，一项研究在VH2-70*01和VH2-70*15杂合的个体中鉴定了VH2-70/DH4-17头部结合类[7]。HA结合抗体富集了VH2-70*01，并发现VH2-70*15等位基因在互补位外包含一个Arg50，与HA结合不相容[7]。
VH1-69是等位基因多态性的经典例子之一。多年前已认识到某些等位基因在CDRH2中编码Phe54，属于规范IF基序的一部分，而约13%的人群为Leu54纯合子[27, 82, 83]。然而，编码Leu54的等位基因纯合子个体仍可使用替代方式结合HA茎部，产生强大的VH1-69类HA茎部反应[17, 27, 84]。使用人源化小鼠模型，Sangseland等人发现由Leu54编码的来自小鼠和人类的VH1-69抗体能够结合HA，但更具多反应性并在小鼠中经历中枢耐受[27]。尽管如此，在人群体中发现带有Leu54的VH1-69类抗体并不罕见，因此尚不清楚类似机制是否在起作用[17]。总体而言，这是一个等位基因多态性不消除特定类型反应但改变互补位相互作用的例子，其后果尚不完全清楚。
**5.2 超越遗传学**
然而，越来越清楚的是，与遗传多态性一起，流感暴露的特定亚型和/或毒株也会影响B细胞组库。用H1免疫扩增的茎部结合组库比H5或H2 HA疫苗接种的交叉反应性更低[15]。这被发现是由于结合更保守的中央表位和更不保守的锚定表位的抗体比例差异，以及结合这些表位的抗体广度差异（图2）。用H1免疫增加了靶向泛H1锚定表位的反应比例，而用H2或H5免疫则将反应转向更多地靶向中央表位[15]。此外，H2疫苗接种诱导的少数结合锚定表位的抗体富集了罕见的具有增强交叉反应性的抗体，能够结合该亚型。即使在结合中央表位的VH1-69类抗体中，根据疫苗接种免疫原的不同，广度也存在变化[15, 17]。在HA茎部疏水口袋中，H2 HA含有Phe54HA2，而H5 HA含有Ile54HA2。Phe54HA2的芳香环预计与许多中央茎部结合抗体（包括VH1-69类抗体）冲突。我们发现用H2或H5免疫不改变VH1-69类反应的幅度，但H2疫苗接种扩增的此类谱系被选择为能够容纳Phe54HA2，并且比H1或H5疫苗接种诱导的VH1-69类抗体更具交叉反应性。不同免疫原还可以选择性地扩增个体内特定谱系的不同分支。这在一项研究中得到说明，其中在10年跨度内多个时间点分离了VH6-1类广泛中和谱系的成员。最广泛的克隆成员在H7疫苗接种后检测到，因为获得H7广度需要比其他亚型更多的体细胞突变和成熟。系统发育分析表明，能够结合H7的克隆成员在该时期维持在组库中，但在H7免疫时被选择性扩增[80]。总之，这些数据突出了多供者类内的变异性，以及免疫原中一个残基变化如何改变疫苗接种诱导的B细胞组库，无论在克隆型内还是跨克隆型。
图2 不同亚型暴露改变HA特异性反应的广度。接种H1或H2后，靶向中央或锚定表位的抗体反应比例不同，结合这些表位的抗体交叉反应性也各异。H2疫苗接种总体上引发更具交叉反应性的反应。
然而，用不同免疫原扩增预先存在的记忆B细胞的这些变化通常是暂时的，不太可能改变长期预先存在的记忆B细胞组库。早已知道生命中首先遇到的流感毒株从根本上塑造流感免疫和保护[85, 86]，但免疫保护变化与B细胞组库之间的联系才刚刚开始显现。最近一项研究首次感染H1N1或H3N2的婴儿组库发现，首次感染的亚型改变了结合中央表位的跨组抗体组库[87]。首次感染H1驱动了主要中和H1的反应组库，包括大流行前后H1N1毒株，而H3感染富集了能够中和H3和大流行后H1N1毒株的跨组结合抗体[87]。这些反应性差异与HA中46HA2位置的单残基变化相关。首次感染建立的跨组组库的这些变化可能贯穿终生并影响对后续流感暴露的保护。在另一项研究中，我们检查了首次暴露于H1（1977年后出生）或H2（1957-1968年间H2流行时出生）的个体对H5疫苗接种的中央表位反应[17]。我们调查了首次暴露于具有Ile54HA2或Phe54HA2的HA亚型是否改变了几十年后对H5疫苗接种作出反应的记忆B细胞组库。VH1-69类反应的幅度在两个队列间没有差异。然而，在首次暴露于H2的个体中，对H5疫苗接种作出反应的VH1-69类抗体比首次暴露于H1流感毒株的个体的抗体更具H2交叉反应性[17]。印记毒株从根本上改变了终生茎部特异性组库。
**6 策略：参与特定B细胞组库**
据估计，小鼠中初级反应中超过1500种具有不同互补位的抗体结合HA[88]。在随时间反复暴露抗原变体后，其中越来越少会存活并维持在记忆组库中。靶向特定抗体谱系或多供者类是富集高保护性反应同时最小化非生产性反应的有吸引力的策略（图3）。有多个因素影响抗体的激发、维持、特异性和进化。如上详述，细微差异如H2亚型中央茎部Phe45HA2而非Ile对VH1-69谱系抗体的特异性产生显著影响[17]。改变茎部聚糖定位已显示在小鼠中将抗体特异性从第1组转换为第2组[89]，尽管这不会导致跨组反应性。用与主要组库不相容的抗原免疫可能将组库转移（即使是暂时性）到能够容忍该变化的亚显性组库[26]。在更全球的尺度上，病毒蛋白的构象状态和/或动力学可对其参与的抗体组库产生巨大影响。嵌合HA免疫原由异源头部和茎部结构域组成，被巧妙设计为优先激发靶向保守茎部结构域的抗体[90]。然而，这种设计引入HA三聚体不稳定性，导致三聚体部分解链，暴露生理状态下被遮蔽的隐蔽表位[91]。因此，当嵌合HA在人类中测试时，它们意外地引发了靶向三聚体界面表位的抗体[92]。虽然三聚体界面和其他隐蔽位点特异性B细胞确实自然存在于人类中[93]，但它们在啮齿动物模型外对流感感染的保护作用仍不清楚。
图3 通过疫苗设计策略改变预先存在的组库。为了设计改善流感免疫的疫苗，重要的是理解预先存在的组库并利用这些知识选择性地富集和扩增整个人群中组库的保护性成分。
改变底物结合化学性质的修饰也可能影响抗体组库参与。去除Tyr98HA1（也称为Y98F）上的羟基是削弱HA唾液酸结合性质的常用方法[94]。该替换已显示改变某些HA RBS抗体以及多克隆血清的反应性，表明在免疫原中使用时可能无法参与该位点特异性组库[95]。然而，在接种含有Y98F替换的H2 HA纳米颗粒疫苗的人类中，引发了HA RBS抗体，包括交叉反应性异亚型抗体[96]。因此，受体结合位点抗体可以用含有该替换的免疫原激发。还有几个天然发生的NA替换改变唾液酸结合亲和力和/或NA催化活性。D151G在H3N2病毒中天然发生，已显示增加唾液酸结合同时降低唾液酸酶活性[97]。在H1N1中也发现了类似替换（G147R），增加唾液酸结合但降低唾液酸酶活性[98]。据报道，当NA作为mRNA皮内递送时，唾液酸酶活性与小鼠局部反应原性相关[99]。通过引入D151G替换减少了这种局部反应原性[99]，表明该替换及类似替换在疫苗设计中的潜在效用。
为了无干扰或无竞争地参与特定B细胞，也探索了更还原论的方法。经验测试的更有趣想法之一基于抗独特型抗体的“内部影像”概念[100]。抗独特型抗体识别靶抗体上的特定互补位，产生结构性和化学特征的内部影像。假设上，该内部影像重现了靶抗体识别的表位；因此，参与识别相同表位的B细胞。该假设已在流感以及许多其他病毒背景下测试。在198
